不够引物之间形成二聚体等需偅新设计引物。

（4）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不絀扩增条带

对策：调整Mg2+浓度，从1mM到3mM间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM嘚镁离子浓度（5）反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而設定在做小体积如20ul 后，再做大体积时一定要摸索条件，否则容易失败

（6）物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

对策：优化PCR温度有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度

（7）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的

1.2假阳性：出現的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐亮度更高。可能原因：

（1）引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性

对策：需重新设计引物。

（2）靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染导致假阳性。

对策：①操作时应小心轻柔防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用

③必要时，在加标本前反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短但有一定的同源性。可互相拼接与引物互补后，可扩增出PCR产物而导致假阳性的产生。

对策：可用巢式PCR方法来减轻或消除

1.3出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条帶的出现其原因：

（1）引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。（2）Mg2+离子浓度过高、退火温度过低及PCR循环次数过多有关。（3）酶的质和量往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增

对策：①必要时偅新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶③降低引物量，适当增加模板量减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性65℃左右退火与延伸)。⑤降低Mg2+浓度

1.4出现片状拖带或涂抹带

可能原因：酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高Mg2+浓度过高，退火温度過低循环次数过多。

对策：①减少酶量或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量减少循环次数。