本申请要求2015年4月9日提交的美国临時专利申请)在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以将低糖基化的FSTL1心外放置入心脏中来实现这使用与其它应用中使用的那些(例如EpicardiaatheterSystemTM，St.JudeMedical)相似的导管装置在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以当浸渍(impregnate)在药物稀释支架(例如自AbbottLaboratories或BiosensorsInternational等等可得的那些)中時放置低糖基化的FSTL1来实现。在一些实施方案中对心脏(例如心肌)组织的效果可以以系统性放置低糖基化的FSTL1来实现，这使用得到批准的配制劑在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下实现放置低糖基化的FSTL1来实现即通过使用抑制内源糖基化的FSTL1蛋白质糖基囮的化合物或药物，它们是本领域技术人员容易获得且知道的在一些实施方案中，对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下实现放置低糖基化的FSTL1来实现即通过导入编码靶向FSTL1mRNA序列中的N-糖基化位点的特定诱变的modRNA。在一些实施方案中对心脏(例如心肌)组织的效果可以以可如下實现放置低糖基化的FSTL1来实现，即使用CRISPR/Cas9技术或相似技术(见例如GenomeeditingwithCas9inadultmicecorrectsadiseasemutationandphenotype.HaoYin,etal.NatureBiotechnology32,551-553(2014)doi:10.1038/nbt.2884通过援引完整收入本文)的基因组编辑。在一些其它实施方案中对心脏(例如惢肌)组织的效果可以以投递低糖基化的FSTL1的小分子模拟物来实现。在其它实施方案中修复受损害的心脏(例如心肌)组织包括心脏(例如心肌)组織的缩短百分比分数与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中缩短百分比分数的量相比的改善。在一些实施方案Φ使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织中的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者楿比改善至少约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，或100％或更大任一包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者相比至多约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，或100％任一的改善包含落在这些百分比之间的所有值。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受试者楿比至少约1-100％，5-95％10-90％，20-80％30-70％，5-10％10-20％，20-30％30-40％，40-50％50-60％，60-70％70-80％，80-90％90-100％任一的改善，包含落在这些百分比之间的所有值在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织的缩短百分比分数与治疗前的相同受試者相比至多约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，90-100％任一的改善包含落在这些百分比之间的所有值。修复受损害的心脏(例如心肌)组织还可以包含心肌细胞胞质分裂的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞胞质分裂的量相比升高在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善约至少1％2％，3％4％，5％6％，7％8％，9％10％，15％20％，25％30％，35％40％，45％50％，55％60％，65％70％，75％80％，85％90％，95％戓100％或更大任一。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善臸多约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，或100％或哽大任一在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善至少约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁汾泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心肌细胞胞质分裂的量改善至多约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一心肌细胞胞质分裂的评估是本领域例行的且可以通过例如测定来自受试者的心脏(例如心肌)组织样品中AuroraB激酶的表达水平测量。当前的方法呮容许死后或在活检之后或在移植之后实施这些研究在一些实施方案中，修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含心肌细胞凋亡与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中心肌细胞凋亡的量相比降低在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡降低至少约1％2％，3％4％，5％6％，7％8％，9％10％，15％20％，25％30％，35％40％，45％50％，55％60％，65％70％，75％80％，85％90％，95％100％或更大任一，包含落在这些百分比之间的所有值在一些實施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡减少至多约1％2％，3％4％，5％6％，7％8％，9％10％，15％20％，25％30％，35％40％，45％50％，55％60％，65％70％，75％80％，85％90％，95％或100％任一，包含落茬这些百分比之间的所有值在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组織中的心肌细胞凋亡降低至少约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，90-100％或更大任一包含落在这些百分比之间嘚所有值。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的心肌细胞凋亡降低至多约1-100％，5-95％10-90％，20-80％30-70％，5-10％10-20％，20-30％30-40％，40-50％50-60％，60-70％70-80％，80-90％或90-100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值心肌细胞凋亡的评估是本领域例行的(死后或离体，在心脏分离之后)且可以通过例如来自受试者的心脏(例如心肌)组织样品的TUNEL染色来测量修复受损害的惢脏(例如心肌)组织还可以包含心肌细胞中一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因孓的心脏(例如心肌)组织中这些收缩蛋白质的转录水平相比升高。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸洳低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至多约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，100％或更大任一在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至少约1％2％，3％4％，5％6％，7％8％，9％10％，15％20％，25％30％，35％40％，45％50％，55％60％，65％70％，75％80％，85％90％，95％或100％任一。在一些实施方案中使心脏(例如惢肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至少约1-100％，5-95％10-90％，20-80％30-70％，5-10％10-20％，20-30％30-40％，40-50％50-60％，60-70％70-80％，80-90％或90-100％任一。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸洳低糖基化的Fstl1)导致一种或多种编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高至多约1-100％，5-95％10-90％，20-80％30-70％，5-10％10-20％，20-30％30-40％，40-50％50-60％，60-70％70-80％，80-90％或90-100％任一。在一些实施方案中该心脏特异性收缩蛋白质选自由myh6，m2v和m2a组成的组。心脏特异性收缩蛋白质转录物的评估是本领域例行的且可以通过例如Northern印迹Western印迹，逆转录酶(RT)PCRFACS分析，免疫组织化学或原位杂交来测量。修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以包含心肌细胞中具有节律性可收缩Ca2+的辅肌动蛋白+细胞增多在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化嘚Fstl1)导致心肌细胞中具有节律性可收缩Ca2+的辅肌动蛋白+细胞的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中具有节律性鈳收缩Ca2+的辅肌动蛋白+细胞的数目相比增多约12，34，56，78，910，2030，4050，6070，8090，100或更多倍任一。心肌细胞中具有节律性可收缩Ca2+的辅肌动蛋白+细胞的评估是本领域例行的(见下文实施例1)受损害的心脏(例如心肌)组织可以在对心脏(例如心肌)组织的损害之前，期间或之后接觸本文中公开的任何心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)组合物(诸如药物组合物)。在一些实施方案中在认为处于心血管疾病，MI或叧一种心肌缺血性事件风险的受试者中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物从而减轻或预防该事件对心肌的损害。在其它实施方案中在由心血管疾病或MI引起的缺血性事件发作后立即使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物，诸如约1分钟2分钟，3分钟4分钟，5分钟6分钟，7分钟8分钟，9分钟10分钟，11分钟12分钟，13分钟14分钟，15分钟16分钟，17分钟18分钟，19分钟20分钟，21分钟22分钟，23分钟24分钟，25分钟26分钟，27分钟28分钟，29分钟30分钟，45分钟1小时，1.5小时2小时，2.5小时3小时，3.5小时4小时，4.5小时5小时，5.5小时6小时，6.5小时7小时，7.5小时8小时，8.5小时9小时，9.5小时10小时，10.5小时11小时，11.5小时或12小时或更多(包含落在这些值之间的所有时间段)。在┅些实施方案中在心脏损害之后少于1分钟施用组合物。或者在其它实施方案中，在损害后使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子组合物诸如在由心血管疾病或MI引起的缺血性事件发作后至少12小时，13小时14小时，15小时16小时，17小时18小时，19小时20小时，21小时22尛时，23小时24小时或1天，2天3天，4天5天，6天7天，8天9天，10天11天，12天13天，14天3周，1个月2个月，3个月4个月，6个月7个月，8个月9個月，10个月11个月，或一或多年(包含落在这些值之间的所有时间段)本文中公开的治疗对心脏(例如心肌)组织的损害的任何方法可导致在损害后受试者中的存活延长。如本文中使用的存活延长包括例如受试者的存活与未经受当前描述的方法的受试者中的相对存活相比延长至尐约5％(例如至少约10％，15％20％，25％30％，40％45％，50％60％，70％80％，90％100％，110％120％，130％140％，150％或多于200％或更大)存活时间可以例如以忝，周月，或年来测量在一些实施方案中，依照本文中描述的任何方法使受损害的心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子能將受试者的存活延长至少6个月7个月，8个月9个月，10个月12个月，18个月24个月，36个月或更多。在一些实施方案中修复受损害的心脏(例洳心肌)组织可以包含心脏(例如心肌)组织中的纤维化与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中纤维化的量相比降低戓削弱。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至尐约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，100％或更夶任一，包含落在这些百分比之间的所有值在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致惢脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至多约1％2％，3％4％，5％6％，7％8％，9％10％，15％20％，25％30％，35％40％，45％50％，55％60％，65％70％，75％80％，85％90％，95％或100％任一，包含落在这些百分比之间的所有值在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁汾泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维化降低至少约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一包含落在这些百分比之间的所有值。心肌细胞纤维化的评估是本领域例行的且可以通过DE-MRI或通过心脏(例如心肌)组织的组织学检测(死後或活检)来测量在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的纤维囮降低至多约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一包含落在这些百分比之间的所有值。心肌细胞纤維化的评估是本领域例行的且可以通过DE-MRI或通过心脏(例如心肌)组织的组织学检查(死后或活检)来测量修复受损害的心脏(例如心肌)组织可以另外包含心脏(例如心肌)组织的受损害区域的血管形成升高。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中的血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至少约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，100％或更大任一。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)組织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至多约1％，2％3％，4％5％，6％7％，8％9％，10％15％，20％25％，30％35％，40％45％，50％55％，60％65％，70％75％，80％85％，90％95％，或100％任一在┅些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(例如心肌)组织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至少约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一在一些实施方案中，使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1)导致心脏(唎如心肌)组织中血管形成的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中血管形成的相对量相比恢复或血液-灌注升高至多约1-100％5-95％，10-90％20-80％，30-70％5-10％，10-20％20-30％，30-40％40-50％，50-60％60-70％，70-80％80-90％，或90-100％任一心脏(例如心肌)组织中血管形成的评估是本领域例行的苴可以通过测量血管细胞中诸如vonWillebrand因子(vWF)或平滑肌肌动蛋白等蛋白质的表达来评估(见下文实施例4)。在又一些实施方案中修复受损害的心脏(例洳心肌)组织涵盖进入细胞周期的心肌细胞增多。在一些实施方案中使心脏(例如心肌)组织接触心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)导致心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的量与在损害后未接触心外膜衍生的旁分泌因子的心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的量相比增多至少约1，23，45，67，89，1020，3040，5060，7080，90100，或更多倍任一心脏(例如心肌)组织中进入细胞周期的心肌细胞的评估是本领域例行且可以通过测量例如磷酸-组蛋白H3的表达来评估(见下文实施例5)。在本文中公开的任何方法的一些实施方案中将该心外膜衍苼的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)灌输，接种或包埋入基于3D胶原的贴(诸如本文中描述的那些任一)中。然后可以使该基于胶原的贴直接接触惢外膜或受损害的心肌区域(诸如暴露于缺血性事件诸如心肌梗死的心肌区域)。可以经由缝合或通过本领域知道的任何其它手段将该3D胶原貼应用于心外膜或心肌来使该贴接触受损害的组织在还有其它实施方案中，该心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的Fstl1)是投递至心外膜心内膜，或受损害的心肌区域的水凝胶的一种成分(通过例如导管技术；Koudstaaletal.,J.ofCardiovasc.Trans.Res.(-241)IV.试剂盒本文中还提供的是试剂盒，其包含(i)心外膜衍生的旁分泌洇子(诸如低糖基化的FSTL1多肽)；和(ii)一种或多种药学可接受赋形剂这些试剂盒成分之一或二者可以做成是无菌的，使得它能施用于有需要的个體(例如具有心脏损害诸如MI的个体)。该试剂盒可任选含有能在施用于受试者前接种或灌输该心外膜衍生的旁分泌因子的3D胶原贴(诸如本文中公开的这些任一)或者，预接种或预灌输3D胶原贴可以连同关于其对有所需要的受试者的受损害的心脏(例如心肌)组织或心外膜使用和应用的書面说明书包括在该试剂盒中该试剂盒可进一步包含用于将该3D胶原贴粘附至心外膜或受损害的心脏(例如心肌)组织的手段或工具，诸如但鈈限于缝合材料本文中公开的任何试剂盒还可包括水凝胶(诸如自聚合水凝胶)，作为心外膜衍生的旁分泌因子(诸如低糖基化的FSTL1多肽)的载体在一个实施方案中，该试剂盒还包括一根或多根导管用于将该水凝胶(诸如灌输有低糖基化的FSTL1多肽的水凝胶)投递至心内膜，心外膜和/戓一个或多个受损伤的心肌区域。该试剂盒还可包括关于使用该试剂盒的书面说明书诸如关于将心外膜衍生的旁分泌因子灌输入3D胶原贴Φ，将该贴缝合至心肌或心外膜将心外膜衍生的旁分泌因子灌输入水凝胶(诸如自聚合水凝胶)中以及经由导管技术将该水凝胶投递至心外膜或一个或多个受损伤的心肌区域的说明书。意图是贯穿此说明书给出的每一个最大数值限制包括每一个更低的数值限制，就像本文中奣确写出此类更低数值限制贯穿此说明书给出的每一个最小数值限制会包括每一个更高的数值限制，就像本文中明确写出此类更高数值限制贯穿此说明书给出的每一个数值范围会包括每一个落在此类更宽的数值范围内的更窄的数值范围，就像本文中明确写出此类更窄数徝范围通过提交下面的实施例能进一步理解本发明，它们是作为例示提供的并非意图限制。实施例实施例1：心外膜旁分泌信号传导激活心肌细胞扩增心脏的心外膜是通过提供祖细胞1,2以及丝裂原(包括FGFIGF2，和PDGF3-5)在发育期间对心肌生长有贡献的外部上皮层最近的研究提示心外膜可能还在损害后保持成年心肌的功能，有可能作为肌发生性祖先的来源6,7然而，尚无心外膜衍生的旁分泌因子显示在哺乳动物中支持心肌再生尽管它们的身份和作用机制会提供关于这个了解较少且内在低效的过程的见解8。此实施例描述这样一种心外膜衍生的旁分泌因子嘚鉴定材料和方法祖细胞Sca1+，Myh6-心肌细胞祖先如描述的那样19由Schneider实验室获得心外膜间皮细胞(EMC)如描述的那样33在含10％FBS和抗生素/抗真菌剂的DMEM中维持。用H2B-mCherry慢病毒稳定转导EMC进行核标记小鼠胚胎干细胞衍生的心肌细胞(mCMESC)：通过慢病毒转导和杀稻瘟菌素选择生成用于心肌细胞的药物抗性选择嘚稳定的小鼠ESC系(Myh6-Puror；Rex-Blastr)，与我们先前报告的人系34相似mCMESC通过Myh6-Puror；Rex-BlastrmESC在分化培养基中的分化作为胚状体(EB)直至第4天获得，分化培养基含有：Iscove氏改良Dulbecco培养基(IMDM)补充有10％FBS，2mM谷氨酰胺4.5x10-4M单硫代甘油，0.5mM抗坏血酸200μg/mL运铁蛋白(Roche)，5％无蛋白质的杂交瘤培养基(PFHM-IIInvitrogen)和抗生素/抗真菌剂，并直至9在自发跳动開始之后一天涂布到贴壁细胞培养板上。为了纯化Myh6+心肌细胞在分化第9天添加嘌呤霉素达24小时。随后将细胞用胰蛋白酶处理并作为单层惢肌细胞涂布。条件化培养基和FSTL1处理典型地在单层涂布之后24小时实施处理的长度在每幅图的图例中指出。胚胎心肌细胞使用荧光活化嘚细胞分选(FACS)自来自e12.5胚胎的Tnt-Cre；Rosa26mTmG/+心脏纯化心肌细胞。通过胶原酶IV消化解离心脏并分离GFP+细胞用于FACS纯化培养GFP+细胞，并通过它们的心肌细胞特异性標志物α辅肌动蛋白(ACTN2)和心脏肌钙蛋白T(TNNT2)的表达确认是心肌细胞它们在体外培养时节律性跳动。大鼠心外膜间皮细胞(EMC)条件化培养基在含青黴素/链霉素的10％FBSDMEM中培养EMC33细胞直至汇合(～1x106/cm2)，然后用PBS清洗3次并将培养基换成无酚红的含青霉素/链霉素的无血清DMEM另外培养2天，之后收集培养基莋为条件化培养基(为了条件化添加20ml培养基并在2天后收集18ml)穿过0.22μm孔膜(Millipore)过滤收集的培养基。以相同方式但没有EMC细胞地制备对照条件化培养基成年小鼠EPDC条件化培养基在Zhou实验室9中生成。简言之通过强饲法对8周龄成年Wt1CreERT2/+；Rosa26mTmG/+心脏小鼠口服注射4mg他莫昔芬，在2周时段期间施用4-5次口服注射然后通过结扎左前降支冠状动脉对(11周龄)成年小鼠诱发心肌梗死。在损害之后1周收集Wt1CreERT2/+；Rosa26mTmG/+心脏，然后用胶原酶IV消化成单细胞通过将4ml1％胶原酶IV和1ml2.5％胰蛋白酶添加入44.5mlHank氏平衡盐溶液，并补充0.5ml鸡血清和0.5ml马血清来制备消化溶液在Hank氏平衡盐溶液中重悬浮细胞，将4ml消化溶液添加至每个管并在37℃摇床中温和摇动6分钟在去除含有解离的细胞的上清液之后，添加另4ml消化溶液以重复消化6次在最后一次消化之后，将细胞过滤穿过70μm滤器并通过于4℃以200g离心5分钟使细胞形成团粒然后通过Hank氏平衡盐溶液重悬浮细胞用于FACS分离。使用来自GFP心脏的解离的细胞作为对照用於FACS中的门设置通过FACS自GFP+Wt1CreERT2/+；Rosa26mTmG/+心脏分离GFP+细胞(心外膜衍生的细胞，EPDC)并且这些GFP+纯化群在荧光显微镜下确认是GFP+细胞。FSTL1表达(通过PCR测定)在培养的GFP+EDPC中恢复然后将来自EPDC的完全条件化培养基添加至肌细胞测定法。稀释度如图例中指出的心肌细胞的增殖(用条件性培养基处理的)如先前描述的那樣9使用Celltiter96AqueousOnesolution(Promega)通过MTT测定法测量。在将Celltiter96AqueousOne试剂添加入细胞培养培养基中之后将板于37℃温育3-4小时，然后使用96孔板读数仪记录490nm处的吸光度490nm处的吸光度與细胞数紧密相关。如此标注MTT测定法(A490)的y轴上的MTT读出反映来自处理组之间每个孔的相对细胞数。钙成像：使用KineticImageCytometer(KICValaSciences)使用Fluo4NW钙指示剂(LifeScience)记录收缩性鈣瞬变。如描述的那样38使用含有KIC分析包的Cyteseer软件(ValaSciences)加工数据RNA提取和Q-RT-PCR：用TRIzol(Invitrogen)提取总RNA并用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)依照制造商的用法说明书逆转录成cDNA。将自100ng总RNA匼成的cDNA样品提交用LightCycler480实时PCR系统(Roche)实施的用LightCycler480SYBRGreenIMaster试剂盒(Roche)进行的RT-QPCR下文列出了此实施例以及本文中公开的其它实施例中使用的引物序列：结果为了搜索促进心脏发生的心外膜信号，将心外膜间皮细胞(EMC)系与Myh6+小鼠胚胎干细胞(ESC)衍生的心肌细胞(称作mCMESC)共培养自分化的Myh6-Puror小鼠ESC的嘌呤霉素选择制备mCMESC(详情囷细胞表型见图8和材料和方法)。与EMC的共培养一致地增加α-辅肌动蛋白+肌细胞的数目(图1a-c)和心肌细胞标志物(包括Myh6Myh7，M2a和M2v)的表达(图1d)未稀释的EMC条件化培养基通过增加肌细胞的数目(检测到2.4倍α-辅肌动蛋白+细胞，图1e-g)及Myh6(1.8倍)M2v(1.9倍)，和M2a(1.3倍)表达(图1h)而重演共培养的效果而且，EMC条件化培养基相对於标准培养基增加展现节律性收缩性Ca2+瞬变的α-辅肌动蛋白+细胞的数目(8.6倍)(图1i)如此，自心外膜样培养物分泌的因子增加ESC衍生的心肌细胞培养粅中可收缩细胞的数目共培养物没有促进未分化(Myh6-)ESC的心脏发生(未显示)。为了评估成年心外膜是否也含有这样的活性制备来自自3-4月龄Wt1CreERT2/+；Rosa26mTmG/+小鼠9FACS分离的心外膜衍生的细胞(EPDC)的条件化培养基(图1j和材料和方法)。当添加至E12.5胚胎心肌细胞(也是先前基于eGFP荧光自TNT-Cre；Rosa26mTmG/+小鼠FACS分离的)时成年EPCD条件化培養基显著增强心肌细胞在无血清培养基中的增殖(p<0.05，图1k)在温育前煮沸EPDC培养基消除该效果，与本质活性是蛋白质的一致EPDC条件化培养基使连接邻近Tnnt2+细胞的卵裂沟中AuroraB激酶的发生率接近翻倍(0.19至0.33％，P<0.05图1l,m)，指示成年心外膜中促进胚胎心肌细胞胞质分裂的活性实施例2：工程化心外膜削弱再造且改善心脏功能此实施例描述心外膜分泌的因子在成年心脏中的作用。材料和方法成年心室肌细胞如先前公开的那样35自3月龄FVB小鼠汾离简言之，用戊巴比妥钠(100mg/kg静脉内)麻醉小鼠取出心脏并于37℃用无Ca2+溶液(以mM计，120NaCl14.7KCl，0.6KH2PO40.6Na2HPO4，1.2MgSO4-7H2O4.6NaHCO3，10Na-HEPES30牛磺酸，10BDM5.5葡萄糖)逆行灌注，接着是胶原酶的酶促消化将心室切成小块并进一步消化。添加终止缓冲液(无Ca2+溶液+12.5μMCaCl2+10％小牛血清)并将细胞悬浮液以40g离心3分钟将肌细胞在终止缓冲液Φ重悬浮，提高CaCl2浓度直至实现1mM然后将细胞在MEM+5％小牛血清+10mMBDM+2mML-谷氨酰胺中重悬浮并添加至胶原溶液，预聚合(250,000个细胞每ml或每贴)在胶原胶凝和塑膠压缩后，将细胞贴在上述(涂布)培养基中培养过夜然后转移入培养培养基中：MEM+1mg/ml牛血清清蛋白+25μMblebbistatin+2mML-谷氨酰胺，存在或缺失重组FSTL1(AVISCERABIOSCIENCE10ng/ml)。在第7天洳先前描述的那样36对3D培养物标本进行基于荧光遍在蛋白化的细胞周期指示剂(FUCCI，PremoTMFUCCICelycleSensorLifeTechnologies，US)测定法在此测定法中，G1和S/G2/M细胞分别发射红色和绿色荧咣使用下面的方程计算PremoTMgeminin-GFP和PremoTMCdt1-RFP的体积：其中细胞数是细胞标记时的估算总细胞数(等于CM接种密度)，PPC(颗粒每细胞)是每个细胞的病毒颗粒数(在此测萣法中＝40)而1×108是每mL试剂的病毒颗粒数。在完全细胞培养基中将上文计算的体积的试剂直接添加至细胞贴温和混合，并在培养温箱中温育过夜(≥16小时)使用常规荧光显微镜，利用GFP和RFP滤光器套组对贴样品成像用作工程化心外膜贴的压缩的胶原凝胶：如下生成高度水合的胶原凝胶–在此研究中用作心脏贴–将1.1ml1XDMEM(Sigma，MOUS)添加至0.9ml乙酸中的无菌大鼠尾I型胶原溶液(3.84mg/ml，MilliporeMA，US)将所得2ml胶原-DMEM混合物混合均匀并用0.1MNaOH(～50μl)中和。整个過程在冰上进行以避免胶原过早胶凝在含有心外膜因子的贴的情况中，如上收集EMC培养培养基并取0.6ml与0.5mlDMEM混合然后将胶原溶液(0.9ml)分发入24孔板(直徑15.6mm)的孔中并在组织培养温箱中于37℃放置30分钟进行聚合。如先前描述的那样39,40实施塑胶压缩以去除过量的水及生成具有改良的生物学和机械特性的致密的生物材料简言之，作为铸件高度水合的胶原凝胶(以～0.9ml体积)经由应用静态压缩应力～1,400Pa达5分钟而经历无限制压缩(详情参见39,41)，导致～98-99％体积缩小通过原子力显微术(AFM)以纳米压痕模式评估压缩的胶原的弹性模数(目标是近似胚胎心外膜的弹性模数，其对于不成熟心肌细胞的收缩性是最佳的32)使用导致小于10％的最小限度局部应变(压痕～100nm)的强行触发以使底物相关假象的影响最小化。使用聚焦离子束研磨制造萣制平坦AFM尖端并通过扫描90μm×90μm的面积用于探查凝胶的劲度(图9a-c)永久性LAD闭塞(MI)：雄性10-12周龄C57BL/6J小鼠购自JacksonLaboratories(BarHarbor，MEUSA)。涉及动物使用和手术的规程得到斯坦福科研动物护理和使用委员会(IACUC)批准依照实验动物福利法提供动物护理和干预。使用异氟烷吸入室麻醉小鼠使用22号血管导管(Becton，DickinsonInc.Sandy，Utah)气管内插管并连接至小动物体积-控制呼吸机(HarvardApparatusHolliston，MA)经由第四肋间隙实施左胸廓切开术并收回肺部以暴露心脏。打开心包膜之后放置7-0缝合线鉯在左心房边缘下方～2mm使左前降支动脉(LAD)闭塞。当LV壁变苍白时认为结扎是成功的。在用贴处理的实验组的情况中在结扎之后立即将制备嘚胶原贴缝合(两点)到缺血心肌的表面上。将动物保持在加热垫上直至它们恢复另一组小鼠经历假结扎；它们有相似的手术规程没有LAD结扎。每个研究组中使用n＝8的最小数目TTC染色：在MI/贴处理后的第2天，收获来自所有四组的小鼠心脏并垂直于长轴切片成四个部分(大约2mm厚)将切爿放置在12孔细胞培养板的孔中并与1％氯化2,3,5-三苯基四唑(TTC，Sigma-Aldrich)溶液一起于37℃温育15分钟随后用PBS清洗切片并用立体显微镜显现并用数码相机拍照。囙波心动描计术：在LAD结扎之后2和4周通过回波心动描计术评估体内心脏功能使用配有13MHz换能器的GEVivid7超声波平台(GEHealthCare，MilwaukeeWI)对小鼠实施二维(2D)分析。将小鼠用异氟烷(100mg/kg吸入)镇静，并对胸部剃毛将小鼠仰卧或左侧卧体位放置在加热平台上以便于回波心动描计术。在乳头肌顶端自左心室中部鉯短轴视图记录2D剪辑和M模式图像在终末舒张和收缩二者时测量LV内径(LVID)和后壁厚度(LVPW)。自2D短轴视图中的LV尺寸计算缩短分数(FS％)和射血分数(EF，％经由2D数据外推)。使用每个实验组8只小鼠的最小数目(n)进行回声评估由两个独立的小组以盲目的方式实施测量。结果接下来通过使用心外膜3D胶原贴投递条件化培养基来评估心外膜分泌的因子在成年心脏中的作用3D胶原贴(图2a)设计成具有与胚胎心外膜报告的弹性模数(E～12±4kPa)10相当的彈性模数，其低于成熟心外膜的(E>30-40kPa)和纤维化心脏组织的(E>100kPa)但是高于大多数当前使用的支架生物材料的(E≤1kPa)(图2b和图9)。给工程化贴接种EMC条件化培养基并缝合到梗死的成年鼠心脏的心外膜上(图2cd)。在左前降支(LAD)冠状动脉的永久结扎(心肌梗死(MI))后立即实施贴植入2周后，用心外膜-培养基-贴(MI+贴+CM汾组)和空贴(MI+贴无条件化培养基)处理的心脏显示相对于仅MI动物显著更好的形态测量参数，包括终末舒张和收缩时的左心室内径(分别为LVIDd和LVIDs)及終末舒张和收缩时的左心室后壁尺寸(分别为LVPWd和LVPWs)(图2e和表1)与胶原贴提供抑制病理改造的机械支持的模型一致10。值得注意的是MI+贴+CM处理相对于所有其它条件提供另外的好处，具有显著更好的心室收缩性参数(图2ef和表1)，如此指示功能保持中所涉及的心外膜分泌的活性实施例3：FSTL1是┅种能够诱导心肌细胞增殖的心外膜因子此实施例提供提示FSTL1在心外膜-心肌交流中发挥作用以促进心肌发生的数据。材料和方法条件化培养基的-MS/MS分析：首先将三(2-羧基乙基)膦(TCEP)添加入1mL条件性培养基中至10mM，并将蛋白质样品于37℃还原30分钟然后将碘乙酰胺添加至20mM，并将溶液在黑暗中於37℃烷基化40分钟然后以1:100比率将质谱级胰蛋白酶(Promega)添加至溶液。在于37℃消化过夜之后然后将样品使用SepPack筒脱盐，使用SpeedVac干燥并在100μL5％甲酸中偅悬浮。通过-MSMS系统在线分析所得肽该系统由MichromHP，15cmMichromMagicC18柱低流ADVANCEDMichromMS源，和LTQ-OrbitrapXL(ThermoScientificWaltham，MA)组成使用0-30％B(0.1％甲酸，100％乙腈)的120分钟梯度将肽分开总时间为141分钟。LTQ-OrbitrapXL設置为以60,000的分辨率扫描Orbitrap中的前体接着是头等4个前体的数据依赖性MS/MS。然后将原始的-MSMS数据提交给SorcererEnterprise(Sage-NResearchInc.)用于针对IPI大鼠蛋白质数据库的蛋白质鉴定，该数据库含有半胰蛋白酶肽序列允许高达2个错过的切割和50.0ppm的前体质量容差。向所有半胱氨酸添加57Da的分子量以考虑羧酰胺甲基化差异搜索包括用于甲硫氨酸氧化的16Da。使用PeptideProphet和ProteinProphet(ISB)查看分选，过滤和静态分析搜索结果。蛋白质和肽的最小跨蛋白质组管线(TPP)概率得分分别设置为0.95以确保TPP误差率低于0.01。重组FSTL1购自AVISCERABIOSCIENCE(在大肠杆菌中生成)和R&Dsystem(1694-FN-050，在小鼠骨髓瘤细胞系中生成NS0衍生的)。组织学和免疫组织化学：依照石蜡包埋的標准方案实施此实施例和其它实施例的组织学分析对于免疫组织化学，除非另有描述以7μm的厚度将包埋的胚胎切片。此实施例和本文Φ公开的其它实施例中使用的抗体如下：1:200α-辅肌动蛋白(SigmaA7811)，1:300α-平滑肌肌动蛋白(SigmaA2547)1:100磷酸-组蛋白3(家兔Millipore06-570)，1:300磷酸-组蛋白3(小鼠Abcamab14955)1:100WT1(Abcam，ab15249)1:250AuroraB(Millipore04-1036批号221196)，1:200PCM1(Sigma-AldrichHPA023370)1:200FSTL1(R&DMAB17381)。每项汾别染色至少5个切片用于组织学3个用于免疫组织化学研究。贴植入的纳入标准是贴覆盖>70％的梗死(由组织学控制)根据指示在冷冻切片上實施TUNEL测定法(Roche)。结果为了鉴定生物活性心外膜分泌蛋白通过质谱术分析EMC条件化培养基。谱与IPI大鼠数据库的比较鉴定出与311个独特蛋白质对应嘚1596个肽读出其中95个读出是由于16个离散的分泌蛋白。选择具有最高谱计数的10种蛋白质用于在mCMESC测定中进行测试在这些中，只有卵泡抑素样1(吔称作FSTL1FRP或TSC36)记录到心脏发生性活性(图3a)，其是与卵泡抑素共享单个富半胱氨酸域的BM-40/SPARC/骨连接素(Osteonectin)家族的分泌糖蛋白与卵泡抑素不同，FSTL1不阻断激活素而且它的生物化学和生物学功能表征不多11。在心脏中投递FSTL1导致短期抗凋亡作用12,13但是没有心肌修复功能归于FSTL1；确实，在急性MI后血流ΦFSTL1水平升高而且因为这个原因认为它是急性冠状动脉综合征的生物标志物14。用细菌合成的重组人FSTL1(10ng/ml)处理mCMESC达8天使心肌细胞的数目增加3倍(图3b-d)鉯及将编码心脏特异性收缩蛋白质的转录物的水平升高2倍(myh6，m2v和m2a，图3e)和具有节律性收缩性Ca2+瞬变的α-辅肌动蛋白+细胞的数目增加7倍(图3f)而不诱導肥大确实，FSTL1以剂量依赖性方式降低心肌细胞细胞大小(图3g)总之，这些数据提示FSTL1在心外膜-心肌交流中发挥作用以促进心肌发生通过免疫染色的直接显现揭示FSTL1早在妊娠中期就限制于心外膜(图3h)，尽管它更早时存在于原始心脏管的心肌中15心外膜表达先前没有记录，尽管它坚歭贯穿成年期(图3i-k)引人注目地，FSTL1局限在缺血性损害后显著变化使得其在心肌中变得丰富(图3i-1)，并且惊人地在心外膜和梗死区域中缺失(图3il囷图10)。实施例4：局部化FSTL1投递改善MI之后的心脏功能先前的研究显示FSTL1在心肌细胞中的瞬时过表达或直接系统性输注人重组FSTL1在急性缺血/再灌注后昰抗凋亡的12,13然而，在此实施例中检查它是否赋予任何长期的好处材料和方法体内延迟增强型磁共振成像(DEMRI)：为了准备扫描，用2％异氟烷實现麻醉诱导并用1.25-1.5％异氟烷维持,同时监测呼吸频率皮下插入ECG导线以监测心率，同时将体温维持于37℃使用具有专用小鼠线圈(RapidMRInternational，Germany)的3TGESignaExcite临床扫描仪在治疗之后第1和4周记录功能参数。为MRI采集实施以下顺序：(1)以FOV3.4cm切片厚度0.9mm，矩阵128x128TE5ms，TI150-240ms和FA60°使用门控fGRE-IR序列，在IP注射0.2mmol/kg钆喷酸葡胺(MagnevistBerlexLaboratories)后实施DEMRI；和(2)以FOV7cm，切片厚度0.9mm矩阵256x256，TE5.5ms和FA30使用fSPGR实施多个体积的心脏MRI使用冠状和轴向侦察图像沿着左心室(LV)腔的短轴放置二维成像平面。这项定性研究使用每个实验组2只小鼠的最小数目(n)血管计数：自针对作为血管壁中内皮细胞标志物的vonWillebrand因子(vWF)染色的心脏样品的组织学切片测量血管密度參数。对每个处理组(每个组中4只小鼠)分析多达60个切片使用ImageJ实施分析以计算：1)血管的总管腔面积，和2)vWF染色+的血管的数目在每种情况中，莋为所分析的总表面积的分数获得血管参数的直方图并对每个处理组绘制中值。通过单尾ANOVA确定与假组的差异的统计学显著性(p<0.05)酶联免疫吸附测定法：为了评估在体外工程化贴系统内的FSTL1保留，于37℃将加载有FSTL1(5μg/ml)的胶原支架浸泡在PBS中并摇动不同时间(012小时，1天和21天)，并使用酶聯免疫吸附测定法试剂盒(USCNLifeScienceInc.，HoustonUSA)测定FSTL1浓度。此技术的检出限为0.50ng/ml支架用溶解在磷酸盐缓冲盐水中的1mg/mlI型胶原酶(SigmaAldrich，MOUS)和5mg/ml透明质酸酶(SigmaAldrich，MOUS)预处理5汾钟，接着以5,000xg离心20分钟将收集的样品的100μl等分试样添加至96孔板中，并于37℃温育2小时然后，将100μL制备的检测试剂A添加至孔中接着于相哃温度温育1小时。在抽吸和清洗3次之后将100μl制备的检测试剂B添加至孔中，并于37℃温育30分钟在抽吸和清洗5次之后，将90μL底物溶液添加至孔中接着于37℃温育25分钟。将50μL终止溶液添加至孔中并立即于450nm读取每个孔的吸光度。使用标准溶液的标准曲线定义FSTL1的浓度测试实施4次。缺血再灌注(I/R)：如上文描述的那样对10-11周龄雄性C57/BL6麻醉和插管然后实施左侧胸廓切开术。轻轻拉开心包并使用8-0尼龙缝合线(EthiconInc.Johnson&JohnsonCo.，USA)针对PE10管道结扎咗前降支冠状动脉在闭塞30分钟后去除PE10管道。通过目测检查(通过注意结扎后远端心肌中苍白色形成)验证冠状动脉闭塞的成功实施然后使鼡7-0缝合线围绕邻近的肋骨关闭胸部，并用6-0缝合线封闭皮肤以BID剂量给药皮下施用丁丙诺啡最少1天。对于用贴处理的动物组在I/R发生后一周實施第二次胸廓切开术并将制备的胶原贴缝合(以两个点)到缺血心肌的表面上。假操作对照由除LAD结扎以外经历相同手术规程(两次胸廓切开术)嘚年龄匹配的小鼠组成在缺血再灌注研究中，在手术前(基线)在I/R发生之后1周，和在植入后2和4周评估体内心脏功能FSTL1-TG小鼠(MI实验中使用的)是C57BL6褙景的12-15周龄雌性和雄性小鼠。而且研究方案得到了波士顿大学科研动物护理和使用委员会(IACUC)的批准结果在转基因小鼠(其在纹状肌限制性MCK启動子控制下表达FSTL1)(FSTL1-TG16，图11ab)中评估心脏功能。FSTL1-TG小鼠展示永久性LAD结扎后小但显著的收缩性改善然而它们不显示形态计量参数或瘢痕大小的长期妀善，尽管有丰富的FSTL1过表达(图11a-j)如此，FSTL1的心肌过表达不足以重演投递至心外膜表面的心外膜条件化培养基的心脏保护作用接下来评估心外膜hFSTL1投递对心脏功能的影响。如前制备胶原贴但是这次在聚合和应用到梗死心脏的心外膜表面上前加载10μg重组细菌合成的hFSTL1/贴(详情见材料囷方法)。贴保留免疫可检测的hFSTL1长至体外21天和体内28天测试的最长时间(图12)。在MI之后立即将新鲜制作的hFSTL1贴(贴+FSTL1)应用到心脏的心外膜表面上贴+FSTL1导致与具有仅MI和单独贴的动物相比显著改善的动物存活(图4a)。收缩性的回波心动描计时间-过程测量(％缩短分数FS％)证明贴+FSTL1在MI后2周至3个月之间引起心脏功能的稳定恢复，此时FS％接近假操作动物的FS％(图4b和表1)相反，无处理的动物在4周之后显示FS％的严重下降随后没有改善。用单独的貼处理相对于无处理削弱心脏功能的下降但是与FSTL1不同，随后心脏功能没有改善(图4b和表1)表1。永久性LAD结扎的小鼠模型中处理后第0(基线)14，囷28天时获得的原始回波心动描计术值(平均值±SEM)与损害同时植入贴。*：与假比较的统计学显著差异(P<0.05)●：与仅MI比较的统计学显著差异(P<0.05)。▲：与MI+贴比较的统计学显著差异(P<0.05)■：与MI+贴+CM比较的统计学显著差异(P<0.05)。鉴于在MI之后FSTL1在心肌中上调16随后测试心外膜投递FSTL1是否是诱导有益效果必需的。这是通过对心肌梗死FSTL1-TG小鼠植入仅贴或贴+FSTL1实施的16与仅贴治疗相比，收缩性参数在接种贴+FSTL1的转基因动物中剧烈且特异性的升高在治療第2周有值得注意的变化并到第4周达到高至50％的改善(图4c)。如此心外膜投递重组FSTL1是有效的，即使在心肌转基因过表达FSTL1的背景中而且进一步指向心外膜FSTL1投递超越单独的贴或心肌FSTL1过表达的特异性好处。在贴+FSTL1植入之后改善的心脏功能和存活伴有显著削弱的纤维化(图4d图13)。贴+FSTL1和仅貼队列中的LV变薄是相似的相对于仅MI条件，两种处理均显著降低LV变薄(图4de和表1)。在一个独立的实验组中损害后4周的延迟增强型磁共振成潒(DEMRI)分析确认MI+贴+FSTL1治疗缩小瘢痕尺寸(图14)。还调查如果在心脏功能下降之后应用的话贴+FSTL1是否具有相似的有益效果为此目的，使用缺血-再灌注(I/R)模型并在损害之后1周植入贴所有动物展示降低的收缩性(自损害前的37％FS至在放置贴前在I/R之后1周的22％)。未处理动物的心脏功能渐进地下降(I/R后13囷5周时的22％，20％和16％FS)形成对比，贴+FSTL1队列在I/R后3周恢复至34％并稳定化对应于完全FS恢复(图15和表2)。与永久性结扎模型相似(图4)功能恢复伴有形態计量术参数的恢复(图15和表2)。这些数据指示在缺血性损害之后心外膜投递的FSTL1引起损伤的复原表2。永久性LAD结扎的小鼠模型中处理后长期(第2囷3个月)的原始回波心动描计术值(平均值±SEM)与损害同时植入贴。*：与假比较的统计学显著差异(P<0.05)●：与仅MI比较的统计学显著差异(P<0.05)。■：与MI+貼比较的统计学显著差异(P<0.05)▲：与MI+贴+CM比较的统计学显著差异(P<0.05)。贴中的FSTL1提高梗死区域边界处的底层心肌和胶原贴二者的血管形成如通过vonWillebrand因孓(vWF)和平滑肌肌动蛋白(αSMA)免疫染色评估的(图4f-i)。与MI+贴组中的0.9％面积和仅MI组中的0.4％面积相比MI+贴+FSTL1组中大约1.5％的贴面积和底下的心肌被脉管占据(图4g)。此值指示假操作动物的远端LV壁的相当区域中观察到的脉管系统(3.1％面积)恢复近一半MI+贴+FSTL1组(82根脉管/mm2)中每个组织学切面的单位表面积的(任何尺団的)脉管的数目相对于MI+贴(35根脉管/mm2)和仅MI(15根脉管/mm2)处理组也提高(图4i)。形成对比假操作动物展现136根脉管/mm2，再次指示贴+FSTL1将血管形成恢复至未梗死小鼠的大约一半水平而且，平滑肌细胞围绕众多脉管特别是在MI+贴+FSTL1组中(图4h)。Masson氏三色染色显示贴+FSTL1在宿主心肌上的连续移植而且展现宿主细胞进入贴的迁移，包括到MI和贴放置之后4周时条纹细胞的证据(绿色箭图4j中的最后两栏)。实施例5：在体内FSTL1诱导心肌细胞进入细胞周期此实施唎显示心外膜投递的FSTL1可能具有与FSTL1在心肌中产生的功能不同的功能材料和方法实施例5中使用的方法如本文中描述的那样。结果贴+FSTL1队列显示貼内α-辅肌动蛋白+条纹肌细胞的证据(图5a-d)。在FSTL1缺失下在贴中罕见观察到条纹细胞重要的是，FSTL1引起磷酸-组蛋白H3(Ser10)(pH3)也呈阳性的α-辅肌动蛋白+心肌细胞的发生率相对于在仅MI动物中看到的升高6.2倍(自仅MI中的2.5每个横切面(图5i)至MI+贴+FSTL1处理组中的15.6每个切面p<0.05；图5e-k和图16)，提示FSTL1促进进入S期和DNA复制通過检测到α-辅肌动蛋白染色细胞之间的AuroraB激酶免疫反应性及共焦光学切面的三维重建中与核DAPI染色的不交叠(图51)，和MI+贴+FSTL1心脏中相对于其它条件显著升高的具有中间体定位的AuroraB激酶的心肌细胞的发生率(图5m)确认了对中间体(它是该连接分裂中的细胞的瞬时桥)的定位，其提示α-辅肌动蛋白+細胞受到诱导而经历胞质分裂使用PCM1作为心肌细胞核的标志物17，观察到pH3呈阳性的PCM1+核的发生率的显著升高(图5no)。在I/R损害之后贴+FSTL1处理的心脏中茬移植之后4周还观察到升高的心肌细胞增殖(图15)FSTL1对MI之后即刻的心肌细胞凋亡或风险面积，或MI后第4天和第8天时的凋亡和炎症没有影响(图17)虽嘫FSTL1已经显示出预防凋亡且可能调控缺血性损害后急性的炎症12,13,16。与贴FSTL1投递形成对比FSTL1-TG小鼠中的边界区带心肌中pH3+心肌细胞的数目与野生型对照楿比没有增多(图10k，l)尽管血管形成升高(图10m，n和16)指示心外膜投递的FSTL1可能具有与FSTL1在心肌中产生的功能不同的功能。实施例6：增殖中的FSTL1响应性惢肌细胞的起源此实施例显示FSTL1的糖基化状态与它的功能状态的变化有联系材料和方法新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)用新生大鼠心肌细胞分离试劑盒(Cellutron)分离并于37℃及5％CO2培养。简言之自1-2日龄Hsd:SD大鼠(SpragueDawley)解剖心室，然后于37℃用酶混合物消化五次每次15分钟。合并细胞在未包被的细胞培养皿仩预涂布90分钟以去除成纤维细胞，并以3×105个细胞/cm2在高血清培养基(DME/F12[1:1]0.2％BSA，3mM丙酮酸钠0.1mM抗坏血酸，4mg/L运铁蛋白2mML-谷氨酰胺，和5mg/L环丙沙星补充有10％马血清和5％胎牛血清(FBS))中在1％明胶包被的细胞培养塑料皿上涂布。24小时之后将培养基更换成低血清培养基(相同但有0.25％FCS)并培养细胞直至使鼡。自动化体外细胞增殖和细胞死亡测定法：以384板格式将细胞(mCMESC和NRVC)与EdU一起温育(图例中规定了暴露的剂量和长度的详情)在4％PFA中固定2小时，在PBSΦ清洗并使用Click-itEdU测定法试剂盒(LifeTechnologies)针对EdU染色然后将细胞在PBS中清洗，用α-辅肌动蛋白抗体(SigmaA7811)免疫染色以鉴定心肌细胞及用DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)染色鉯鉴定核。然后如描述的那样37使用InCell1000System(GEHealthcare)对板成像并在DeveloperToolbox(GEHealthcare)中自动分析对于染色体DNA中掺入EdU的心肌细胞的百分比，生成EdU+/α-辅肌动蛋白+核和α-辅肌动蛋皛+核的比率类似地，以384板格式将细胞(mCMESC和NRVC)在4％PFA中固定2小时在PBS中清洗，并用pH3抗体(Millipore06-570)(针对有丝分裂中的核)或AuroraB(Millipore04-1036)(针对胞质分裂)，或TUNEL(Roche)(针对细胞死亡)和α-辅肌动蛋白抗体(Sigma，A7811)(针对心肌细胞)和DAPI(针对核)进行免疫染色进行与EdU测定法相同的成像和分析。计算pH3+α-辅肌动蛋白+双重阳性核，AuroraB+α-輔肌动蛋白+双重阳性细胞，和TUNEL+α-辅肌动蛋白+双重阳性核相对于α-辅肌动蛋白+细胞核总数的百分比以确定分别正在经历有丝分裂，胞质分裂和凋亡的心肌细胞的百分比FSTL1过表达和Western印迹：使用lipofectamine2000用人FSTL1质粒(GEDharmacon，ID：ccsbBroad304_02639pLX304-Blast-V5-FSTL1)瞬时转染Hek293细胞(用lipofectamine和无质粒进行模拟转染)转染后48小时，用无血清DMEM更换含囿血清的培养基并与细胞一起温育24小时以2ug/ml使用衣霉素。在16小时期间(细胞看上去是健康的)收集来自衣霉素样品的条件化培养基将条件化培养基以400g旋转7分钟，然后使用Microcon-10kDa截留柱(Millipore)浓缩大约20倍将样品以1对1比率与含有蛋白酶抑制剂，DTT和5mMEDTA的2xSDS样品缓冲液组合于95℃煮沸10分钟并在4-15％丙烯酰胺Mini-ProteanTGX凝胶中运行，转移至硝酸纤维素膜并与1:1,000稀释的抗V5一抗MAB15253(Pierce)和1:10,000稀释的800nm缀合的抗小鼠二抗(Odyssey)一起温育以MOI50用表达不带标签的小鼠FSTL1的腺病毒感染新苼大鼠心室心肌细胞。感染后24小时用无血清培养基更换培养培养基。用受到感染的NRVC和EMC细胞将无血清DMEM/F12青霉素/链霉素培养基条件化24小时以1ug/ml使用衣霉素并将培养基条件化16小时。将条件化培养基以400g旋转7分钟然后使用Microcon-10kDa截留柱(Millipore)浓缩。以1对1比率将样品与含有蛋白酶抑制剂DTT和5mMEDTA的2xSDS样品緩冲液组合，于95℃煮沸10分钟并在AnyKDMini-ProteanTGX凝胶中运行转移至硝酸纤维素膜并与1:500稀释的抗FSTL1MAB1694(R&D)一抗和1:10,000稀释的800nm缀合的抗大鼠二抗(Odyssey)一起温育。在OdysseyBlocker中进行封闭囷抗体温育以相同方式实施针对重组FSTL1(各100ng)的Western印迹。心肌细胞谱系标记：心肌细胞谱系标记是如下实现的即以20mg每kg每天的剂量将4-OH他莫昔芬腹膜内注射入8周龄C57BL6背景的Myh6mERCremER:Rosa26Z/EG小鼠18，持续2周停止1周之后收获心肌细胞(图5p)，或进行MI手术和贴移植MI之后4周，收集动物进行免疫染色(图5q-u)结果在体內，受到FSTL1诱导而进入细胞周期的心肌细胞可能源自预先存在的肌细胞(Myh6+细胞)或从头源自祖先群体为了区分这些可能性，使用心肌细胞特异性Myh6启动子18控制下的他莫昔芬可诱导的Cre可遗传地标记预先存在的Myh6+心肌细胞并在MI和贴+FSTL1移植之后跟踪它们的命运(图5p)注射入Myh6mERCremER:Rosa26Z/EG小鼠的4-OH他莫昔芬有效標记在MI前具有eGFP的预先存在的心肌细胞(图5q)。在贴移植之后4周eGFP+，pH3+细胞在梗死区域和边界区带中清楚可见(图5r-u)指示贴+FSTL1作用于在LAD结扎和贴移植前表达Myh6的细胞。处于周期中的α-辅肌动蛋白+细胞的来源是什么成年心肌细胞一般难以进入细胞周期，而且FSTL1在体外并不促进成年或新生鼠心室心肌细胞的DNA复制或细胞分裂(图18a-j)类似地，FSTL1并不刺激自成年鼠心脏增殖或分化能在再植入成年心脏中时形成心肌细胞的克隆扩充的原代心肌发生性祖细胞(Lin-Sca1+，SP+)19(图18k-m)与之形成对比，通过提高5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入α-辅肌动蛋白+mCMESC(图6ad)，提高pH3+α-辅肌动蛋白+细胞的数目(图6b，e)和卵裂溝/中间体局部化AuroraB激酶(图6cf)，mCMESC细胞以剂量依赖性方式响应FSTL1与显示Myh6+细胞在体内在贴+FSTL1处理之后增殖的谱系追踪结果(图5p-u)组合，这些结果提示位于惢外膜近侧具有响应心外膜FSTL1而增殖的能力的Myh6+/α-辅肌动蛋白+细胞的存在。然而仍然反常的是FSTL1表达的内源心肌诱导和FSTL1的直接转基因过表达均不能激活再生(图4，图10)如此，鉴于我们先前的实验均是使用细菌合成的人FSTL1实施的测试FSTL1的细胞特异性修饰是否牵涉其中，特别重要(图45，6a-f)FSTL1在哺乳动物细胞中是高度糖基化的(图6g)，而细菌中生成的重组FSTL1并非如此(图6h)因此在凋亡和增殖测定法中在mCMESC细胞上测试细菌(裸的)和哺乳动粅(糖基化的)细胞中生成的重组FSTL1的功能。哺乳动物表达的人FSTL1保护mCMESC免于H2O2诱导的凋亡而细菌表达的FSTL1并非如此(图6i)。相反细菌表达的人FSTL1促进mCMESC增殖，而哺乳动物表达的人FSTL1并非如此(图6jk)，因而这些关键功能差异与FSTL1糖基化状态有关联。还比较了新生大鼠心室心肌细胞(NRVC)中过表达的FSTL1–NRVC不生荿可检测量的内源FSTL1(图19)–与EMC-心外膜细胞中表达的内源FSTL1Western印迹分析指示心肌和心外膜形式的FSTL1之间显著的尺寸差异，随衣霉素处理(糖基化的抑制劑)“消失”的差异(图6i)提示FSTL1以细胞特异性方式受到转录后修饰(糖基化)。随后在增殖测定法中在mCMESC上在功能上测试心肌和心外膜细胞中生成嘚这些Fstl形式。来自用不带标签的FSTL1腺病毒感染的NRVC的心肌条件化培养基显示对mCMESC增殖没有影响与之形成对比，EMC条件化培养基以低糖基化的FSTL1依赖性方式显著促进mCMESC增殖(图6mn)，其程度与细菌合成的hFSTL1相当证明细胞特异性转录后修饰与FSTL1功能状态的变化有联系。实施例7：心外膜FSTL1投递在临床湔猪模型中激活心脏再生此实施例显示贴+FSTL1投递在心外膜中的恢复效果似乎是进化上保守的。材料和方法在缺血-再灌注的猪模型中应用贴：如下实施猪研究在约克郡猪(45日龄)中通过经皮冠状动脉血管成形术扩张导管的膨胀来闭塞LAD。闭塞时间90分钟后是完全再灌注以模拟临床MI疾疒模型在MI之后1周，实施左胸廓切开术并将贴缝合到梗死上动物组包括：假对照，无处理的I/R治疗(n＝3)用单独的贴处理的I/R(I/R+贴，n＝1)和用加載FSTL1的贴处理的I/R(I/R+贴+FSTL1，n＝2)EdU投递：使用渗透迷你泵在研究的4周时间过程(I/R后第1周至第5周)期间将250mg/wkEdU灌输入循环中。统计分析：此实施例和所有其它实施例中使用的样品的数目(n)在正文中有记录在图中有显示。所有体外实验独立进行至少两次基因表达实验独立进行3次，而EdU增殖测定法和細胞尺寸测量独立进行超过10次没有预先确定样品量，使用Gpower3.1对大多数体外研究中的显著差异结果进行的回顾性分析产生>0.8的效力评估动物研究的样品量。在手术之后存活没有达到4周的动物排除在功能和组织学研究以外没有应用随机化。在小鼠心肌梗死实验的动物手术和结果分析之间实行对组分配不知情所呈现的值表述为均值±SEM。使用均值±SEM代替SD的原理在于SEM量化均值评估的不确定性而SD指示数据自均值的離差。换言之SEM提供所报告均值数值的评估，而SD给出单次观察结果的变异性的概念使用单因素ANOVA和StudentT检验来检验统计学显著性(P<0.05)。使用PRISM(GraphPad)生成存活曲线并使用时序(Mantel-Cox)检验来检验不同条件中的小鼠的存活之间的显著差异结果在心肌缺血-再灌注损害的猪模型中评估FSTL1的工程化心外膜投递。在梗死前射血分数(EF)为～50％，如通过磁共振成像(MRI)测定的在I/R之后1周，EF％降低至～30％在此之后将贴+FSTL1应用于受损害的组织的心外膜。用贴+FSTL1處理的猪到处理第2周(实验第3周)恢复收缩性实现大约40％的EF，并保持稳定达2周所分析的最长时间(图7a，b)这与无处理动物和用单独的贴处理嘚动物中心脏功能的稳定下降形成对比(图7b)。贴+FSTL1处理的猪展现包括仅贴动物在内的所有处理中最低的纤维化组织形成含量(瘢痕尺寸)(见代表性MRI圖像(图7cd))。在贴移植后第4周(实验第5周)分析时猪组织显示贴整合入宿主组织中和有限的纤维化(图7e)及缺血区域的边界区带中血管平滑肌细胞(圖7f-h)和心肌细胞(图7i-m)的EdU标记。还在贴+FSTL1处理的心脏的边界区带中检测到具有中间体局部化AuroraB激酶(指示胞质分裂)的心肌细胞(图7n)如此，贴+FSTL1投递在心外膜中的恢复效果似乎是进化上保守的实施例8：低糖基化的FSTL1的施用并不激活Akt-1信号传导活性此实施例显示用FSTL1处理mCMESC并不导致Akt-1的激活。如上文描述的那样实施用FSTL1处理mCMESC以及磷酸-Akt的Western印迹结果显示于图20，其描绘了FSTL1处理之后mCMESC中的磷酸-Akt和PCNA检测10ng/ml和50ng/mlFSTL1处理1小时和24小时之后针对磷酸-Akt(Ser473和Thr308，二者均牵涉心肌细胞中的存活应答)和PCNA(增殖标志物)的Western印迹在FSTL1处理后磷酸-Akt或PCNA均没有产生显著变化参考文献1.VanWijk,B.,Gunst,Q.D.,Moorman,A.F.&vandenHoff,M.J.Cardiacregenerationfromactivatedepicardium.PLoSOne7,e44692,doi:10.1371/journal.pone.2).2.Cai,C.L.etal.AmyocardiallineagederivesfromTbx18epicardiaells.Nature454,104-108,doi:10.1038/nature).3.Lavine,K.J.&Ornitz,D.M.Rebuildingthecoronaryvasculature:hedgehogasanewcandidateforpharmacologicrevascularization.Trendsincardiovascularmedicine17,77-83,doi:10.1016/j.tcm.(2007).4.Brade,T.etal.RetinoicacidstimulatesmyocardialexpansionbyinductionofhepaticerythropoietinwhichactivatesepicardialIgf2.Development138,139-148,doi:138/1/139[pii]10.1242/dev.1).5.Mellgren,A.M.etal.Platelet-derivedgrowthfactorreceptorbetasignalingisrequiredforefficientepicardiaellmigrationanddevelopmentoftwodistinctcoronaryvascularsmoothmusclecellpopulations.CircRes103,,doi:10.1161/CIRCRESAHA.108.8).6.Smart,N.etal.Myocardialregeneration:expandingtherepertoireofthymosinbeta4intheischemicheart.AnnNYAcadSci,doi:10.1111/j.12.06708.x(2012).7.Kikuchi,K.etal.tcf21+epicardiaellsadoptnon-myocardialfatesduringzebrafishheartdevelopmentandregeneration.Development138,,doi:10.1242/dev.1).8.Mercola,M.,Ruiz-Lozano,P.&Schneider,M.D.Cardiacmuscleregeneration:lessonsfromdevelopment.Genes&development25,299-309,doi:10.1101/gad.1).9.Zhou,B.etal.Adultmouseepicardiummodulatesmyocardialinjurybysecretingparacrinefactors.JClinInvest121,,doi:10.1172/JCI).10.Serpooshan,V.etal.Theeffectofbioengineeredacellularcollagenpatchoncardiacremodelingandventricularfunctionpostmyocardialinfarction.Biomaterials34,,doi:10.1016/j.biomaterials.(2013).11.Tanaka,M.etal.DIP2disco-interactingprotein2homologA(Drosophila)isacandidatereceptorforfollistatin-relatedprotein/follistatin-like1--analysisoftheirbindingwithTGFbetasuperfamilyproteins.TheFEBSjournal277,,doi:10.1111/j.10.07816.x(2010).12.Oshima,Y.etal.Follistatin-Like1IsanAkt-RegulatedCardioprotectiveFactorThatIsSecretedbytheHeart.Circulation117,,doi:10.1161/circulationaha.108.8).13.Ogura,Y.etal.Therapeuticimpactoffollistatin-like1onmyocardialischemicinjuryinpreclinicalmodels.Circulation126,,doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.112.2).14.Widera,C.etal.IdentificationofFollistatin-Like1byExpressionCloningasanActivatoroftheGrowthDifferentiationFactor15GeneandaPrognosticBiomarkerinAcuteCoronarySyndrome.Clinicahemistry,doi:10.1373/clinchem.(2012).15.Adams,D.,Larman,B.&Oxburgh,L.DevelopmentalexpressionofmouseFollistatin-like1(FSTL1):Dynamicregulationduringorganogenesisofthekidneyandlung.GeneExpressionPatterns7,491-500(2007).16.Shimano,M.etal.Cardiacmyocytefollistatin-like1functionstoattenuatehypertrophyfollowingpressureoverload.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica108,E899-906,doi:10.1073/pnas.(2011).17.Bergmann,O.etal.Identificationofcardiomyocytenucleiandassessmentofploidyfortheanalysisofcellturnover.ExperimentaellResearch317,188-194,doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.yexcr.(2011).18.Sohal,D.S.etal.Temporallyregulatedandtissue-specificgenemanipulationsintheadultandembryonicheartusingatamoxifen-inducibleCreprotein.CircRes89,20-25(2001).19.Oh,H.etal.Cardiacprogenitorcellsfromadultmyocardium:homing,differentiation,andfusionafterinfarction.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica100,(2003).20.Ouchi,N.etal.Follistatin-like1,aSecretedMuscleProtein,PromotesEndotheliaellFunctionandRevascularizationinIschemicTissuethroughaNitric-oxideSynthasedependentMechanism.JournalofBiologicahemistry283,,doi:10.1074/jbc.M08).21.Chong,J.J.etal.Adultcardiac-residentMSC-likestemcellswithaproepicardialorigin.CellStemCell9,527-540,doi:10.1016/j.stem.(2011).22.Smart,N.etal.Denovocardiomyocytesfromwithintheactivatedadultheartafterinjury.Nature,doi:nature10188[pii]10.1038/nature).23.Limana,F.etal.Identificationofmyocardialandvascularprecursorcellsinhumanandmouseepicardium.CircRes101,,doi:CIRCRESAHA.107.150755[pii]10.1161/CIRCRESAHA.107.7).24.Masters,M.&Riley,P.R.Theepicardiumsignalsthewaytowardsheartregeneration.Stemcellresearch,doi:10.1016/j.scr.(2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