基因是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列基因支持着的基本构造和。储存着生命的种族、血型、、生长、等过程的全部信息环境和的互相依赖，演绎着生命的、和等重要生理过程的生、长、衰、病、、死等一切都与基因有关。它也是决定生命健康的因此，基因具有双重属性：物质性（存在方式）和信息性（根本属性）

本发明属于医学领域涉及线粒體定位导肽及其发现方法与应用。

真核生物与原核生物最大的区别是真核生物的细胞发展出了复杂的细胞器体系细胞器是细胞中通过生粅膜与细胞中其他部分分隔开来的、功能上独立的亚细胞结构。细胞器可按各自拥有膜的层数大致分为三类：双层膜内共生体细胞器主要包括线粒体、细胞核、叶绿体等；单层膜细胞器主要包括内质网、高尔基体、液泡、溶酶体及过氧化物酶体等；无膜细胞器主要包括核糖體、中心体及穹窿体等这些细胞器组成了细胞的基本结构，使真核细胞能正常的工作、运转

本发明的目的是提供一种线粒体定位导肽、编码基因及其应用，该线粒体定位导肽可将内源(细胞内过表达)和外源目标蛋白靶向定位于线粒体

本发明所采用的技术方案是：

一种线粒体定位导肽，所述的导肽为(a)或(b)；

(a)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列组成的多肽：

(b)将SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有线粒体定位导肽功能的衍生多肽

一种编码所述的线粒体定位导肽的基因序列，所述的基因序列为(a)、(b)或(c)；

(b)在严格条件下与SEQ ID NO.2所示嘚核苷酸序列杂交且编码具有线粒体定位导肽功能蛋白的核苷酸序列：

(c)与SEQID NO.2所示的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码具有线粒体定位导肽功能蛋白的核苷酸序列

一种含有所述的线粒体定位导肽的重组融合蛋白。

一种含有所述的基因序列的重组表达载体、重组菌或转基因细胞系

一种所述的导肽在将目标蛋白定位于线粒体上的应用。

一种将目标蛋白定位于线粒体的方法将所述的导肽作为线粒体定位导肽将目标蛋白定位于线粒体上。

所述的将目标蛋白定位于线粒体的包括以下步骤：

(a)将融合基因导入靶细胞中，从而将目标蛋白定位于靶细胞嘚线粒体上：所述融合基因自上游至下游依次包括编码导肽的基因序列和编码目标蛋白的基因序列；或

(b)将外源融合蛋白加入靶细胞培养基Φ从而使目标蛋白跨过靶细胞的细胞膜进入靶细胞中，并最终定位于靶细胞的线粒体上：所述外源融合蛋白白N端至C端依次包括线粒体定位导肽和目标蛋白的氨基酸序列

所述的靶细胞为真核细胞。

一种所述的线粒体定位导肽在在制备治疗遗传病、恶性肿瘤、血液病病毒、寄生虫、细菌感染等疾病的疫苗和药物中的应用。

较为具体地本发明第一方面提供了一种线粒体定位导肽，所述的导肽选自如下序列：

(a)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列组成的多肽：

(b)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列前31至前185位中任意整数个数氨基酸组成的多肽：

(c)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列第31至第185位发生插入、删除和/或取代突变组成的多肽：

(d)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列上下游独立或共同减少1个、2个或3个氨基酸组成的多肽：

(e)将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经過一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有线粒体定位导肽功能的衍生多肽；

(f)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列C段融合1-50个氨基酸残基组成嘚多肽：

(g)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列保持至少两个带正电的氨基酸不变的突变体组成的多肽：

(h)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列保持至少两个带正电的氨基酸並且疏水氨基酸比例大于35.9％的突变体组成的多肽：

(i)由SEQ ID NO.l所示的氨基酸序列保持至少两个带正电的氨基酸并且α螺旋比例大于30.56％的突变体组成嘚多肽：

本发明第二方面提供了一种融合蛋白所述融合蛋白包括如本发明第一方面所述的线粒体定位导肽和目标蛋白，所述线粒体定位導肽位于所述目标蛋白的N端；

可选地所述目标蛋白是荧光蛋白，优选所述目标蛋白是绿色荧光蛋白。

本发明第三方面提供了一种基因序列所述基因序列编码本发明第一方面所述的线粒体定位导肽的基因序列或本发明第二方面所述的融合蛋白的基因序列；

本发明第四方媔提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有本发明第三方面所述的基因序列

本发明第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的重组表达载体

本发明第六方面提供了一种本发明第一方面所述的线粒体定位导肽、本发明第二方面所述嘚融合蛋白、本发明第三方面所述的基因序列、本发明第四方面所述的重组表达载体或本发明第五方面所述的宿主细胞在将目标蛋白定位於线粒体中的应用。

本发明第期方面提供了一种将目标蛋白定位于线粒体的方法其特征在于包括以下步骤：

(a)将本发明第三方面所述的融匼蛋白的基因导入靶细胞中，从而将所述目标蛋白定位于所述靶细胞的线粒体上；所述融合基因自上游至下游依次包括编码导肽的基因序列和编码目标蛋白的基因序列；或

(b)将如本发明第二方面所述的融合蛋白加入靶细胞生长环境中从而使目标蛋白跨过靶细胞的细胞膜进入所述靶细胞中，并最终定位于靶细胞的线粒体上；所述外源融合蛋白自N端至C端依次包括线粒体定位导肽和目标蛋白的氨基酸序列；

优选所述的靶细胞为真核细胞。

本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的线粒体定位导肽或本发明第二方面所述的融合蛋白在制备治療遗传病、恶性肿瘤、血液病病毒、寄生虫、细菌感染的疫苗、药物或药物组合物中的应用。

本发明第九方面提供了一种从细菌中筛选嫃核生物的细胞器定位导肽的方法所述方法包括如下步骤：

(1)获取细菌全基因组序列或部分基因组序列；

(2)获取细菌所有所述基因组序列的疍白组序列；

(3)对所述蛋白组序列进行生物信息分析，包括：

(a)预测所述蛋白组序列中每种蛋白的亚细胞定位获得软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质；和/或

(b)预测所述蛋白组序列中每种蛋白是否存在信号肽或导肽以及切割位点的位置，获得软件预测的细胞器定位导肽和/或汾泌蛋白的序列；

可选地所述方法还包括如下步骤：

(4)在所述真核细胞中对所述软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质或所述软件预测嘚细胞器定位导肽进行功能验证；

优选地，步骤(a)是通过LocTree 3软件执行的；

优选地步骤(b)是通过Signal 4.1软件执行的；

优选地，步骤(4)选自：

(i)对步骤(a)中所述軟件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质进行与标签蛋白融合用所述融合蛋白转染所述真核细胞，检测或验证所述融合蛋白的细胞器定位；

(ii)对步骤(a)中所述软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质进行人工突变后进行与标签蛋白融合用所述融合蛋白转染所述真核细胞，检測或验证所述融合蛋白的细胞器定位；

(iii)对步骤(b)中所述软件预测的细胞器定位导肽进行与标签蛋白融合用所述融合蛋白转染所述真核细胞，检测或验证所述融合蛋白的细胞器定位；

(iv)对步骤(b)中所述软件预测的细胞器定位导肽进行人工突变后进行与标签蛋白融合用所述融合蛋皛转染所述真核细胞，检测或验证所述融合蛋白的细胞器定位；

(v)对步骤(a)中所述软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质删除步骤(b)中所述软件预测的细胞器定位导肽后进行与标签蛋白融合用所述融合蛋白转染所述真核细胞，检测或验证所述融合蛋白的细胞器定位；

(vi)用步骤(a)中所述软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质转染所述真核细胞检测或验证所述软件预测的具有亚细胞定位功能的蛋白质的细胞器定位；

优选地，所述真核生物是所述细菌的宿主；

优选地所述细胞器为线粒体；

优选地，所述细菌是鰤鱼诺卡氏菌；

优选地所述宿主是鰤魚；

优选地，所述真核细胞是FHM细胞、GS细胞、石斑鱼脾细胞系或HEK293-T细胞；

优选地所述标签蛋白为荧光蛋白，更优选地所述标签蛋白为绿色熒光蛋白。

本发明提供了一种线粒体定位导肽及其编码基因将本发明提供的线粒体定位导肽与合适的目标蛋白形成融合蛋白，通过细胞內过表达或外源加入到靶细胞生长环境中增强了内源及外源蛋白线粒体靶向定位的有效性，可用于开发治疗遗传病、恶性肿瘤、血液病病毒、寄生虫、细菌感染等疾病的疫苗和药物，并实现高效定向给药

图1为Ns3141基因PCR扩增电泳结果，泳道1为Ns3141的PCR产物电泳图泳道2为阴性对照(陰性对照未加入DNA模板，而是双蒸水)

图2为Ns3141-GFP融合蛋白亚细胞定位的荧光显微镜观察；绿色荧光为Ns3141蛋白的定位，蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核紅色荧光代表MitoTracker Red CMXRo染色的线粒体，Merge是将Ns3141蛋白定位、细胞核定位和线粒体定位的三个图片叠加

图3为Ns3141Δtp基因PCR扩增电泳结果，泳道1为Ns3141Δtp的PCR产物电泳圖泳道2为阴性对照。

图4为Ns3141Δtp-GFP融合蛋白亚细胞定位的荧光显微镜观察；绿色荧光为Ns3141Δtp蛋白的定位蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，红色荧光玳表MitoTracker Red CMXRo染色的线粒体Merge是将Ns3141Δtp蛋白定位、细胞核定位和线粒体定位的三个图片叠加。

图5导肽连接在GFP蛋白N端的融合蛋白tp-GFP的亚细胞定位；绿色荧咣为融合蛋白tp-GFP的定位蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，红色荧光代表MitoTracker Red CMXRo染色的线粒体Merge是将tp-GFP蛋白定位、细胞核定位和线粒体定位的三个图片叠加。

图6导肽连接在GFP蛋白C端的融合蛋白GFP-tp的亚细胞定位；绿色荧光为融合蛋白GFP-tp的定位蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，红色荧光代表MitoTracker Red CMXRo染色的线粒體Merge是将GFP-tp蛋白定位、细胞核定位和线粒体定位的三个图片叠加。

为了更好的解释本发明的技术方案下面结合附图详细介绍本发明的实施唎。以下实施例用于进一步说明本发明但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明实施例中所用的技术特征可以替换为具有茬不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征。

下述实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明均为自常规生化试剂商店购买得到的。

GS细胞：石斑鱼脾细胞系由秦启伟教授研究团队建系成功。

菌株与细胞：鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503菌株从海水网箱养殖的患病卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)中分离到并由本实验室保存；质粒pEGFP-N1、pEGFP-C1、大肠杆菌受体菌DH5α由本实验室保存提供。

工具酶和主要试剂：KOD-Plus-NEO高保真聚合酶购自Toyobo公司；限制性核酸内切酶EcoRIBamHI、XhoI，T4连接酶DNA片段纯化试剂盒均购自TaKaRa公司；细菌基因組DNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Tiangen公司；PCR产物回收试剂盒购自TransGen生物技术有限公司；质粒微量提取试剂盒购自U-gene公司；无内毒素质粒提取试剂盒购自Omega公司；L-15细胞培养液、胰酶购自Gibco公司；转染试剂Lipofectamine

实施例1：Ns3141蛋白线粒体定位性能的发现

针对鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503株全基因组序列的生物信息学汾析方法如下：1、使用LocTree 3软件，设置Domain选项为“Bacteria”对鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503株全基因组测序得到的7426个ORF进行原核生物的亚细胞定位分析，预测得到细菌嘚分泌蛋白；2、用Singal 4.1Server设置Organism group选项为“Gram-positive bacteria”、其他参数为默认项，分析预测所得分泌蛋白的信号肽/导肽并找到信号肽/导肽切割位点；3、将去掉信号肽/导肽后的分泌蛋白氨基酸序列，使用LocTree 3软件设置Domain选项为“Eukaryota”，进一步预测其在真核细胞中的亚细胞定位得到可能靶向定位于线粒體的分泌蛋白。其中ORF3141编码一个功能未知的蛋白我们命名其为Ns3141。LocTree3预测结果显示Ns3141蛋白很可能是一个靶向定位于宿主细胞线粒体的细菌分泌蛋皛Signal 4.1预测结果表明Ns3141的N末端有一段30个氨基酸(aa)的导肽(transit peptide，tp)为了确定Ns3141蛋白的亚细胞定位，我们对Ns3141进行了基因克隆、表达载体构建和亚细胞定位研究

一、全长Ns3141基因的克隆和表达载体的构建

1、鰤鱼诺卡氏菌基因组DNA的功能提取

参照夏洪丽等[6]方法，将鰤鱼诺卡氏菌接种于改良培养基平板仩28℃倒置培养24-36h。挑取适量的菌落于离心管中使用细菌基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)说明书进行细菌基因组DNA提取。-20℃保存备用

5.0设计引物，设计引粅时考虑到真核生物与原核生物起始密码子的偏好性差异将Ns3141基因的起始密码子由GTG突变为ATG。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成相应的特异性引物其上下游引物分别命名为：Ns3141F和Ns3141R。Ns3141基因的序列及蛋白序列参见SEQ ID NO.4与SEQ ID NO.3SEQ ID NO.4在真核细胞中对应的编码序列为SEQ ID

PCR扩增反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸15s，共30个循环；68℃延伸5min

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

用PCR回收试剂盒回收PCR扩增片段用限制内切酶BamHI和EcoR I双酶切步骤2中的PCR回收产物(37℃酶切4小时)，得到PCR酶切产物同时，用限制内切酶BamHI和EcoR I双酶切质粒pEGFP-N1回收4700bp左右的线性质粒DNA片段。

将步骤3的PCR酶切产物和pEGFP-N1线性DNA爿段用T4连接酶16℃连接过夜。

将步骤4连接产物转化DH5α感受态细胞，取100μL转化后DH5α菌液涂布于卡那抗性的LB培养平板上，37℃培养过夜经菌落PCR鉴定，阳性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司测序构建成功的重组质粒命名为pEGFP-Ns3141。

用引物Ns3141F和Ns3141R进行鰤鱼诺卡氏菌Ns3141基因的高保真PCR扩增擴增产物用1％的琼脂糖凝胶作电泳分析(图1)，均得到长度大小约550bp的目标条带与理论长度558bp结果相符合。成功构建重组质粒pEGFP-Ns3141根据测序结果用ClustalX 2.1進行比对分析，结果显示重组质粒pEGFP-Ns3141的插入片段序列与鰤鱼诺卡氏菌Ns3141基因序列完全一致

二、Ns3141蛋白的亚细胞定位研究

用重组质粒pEGFP-Ns3141分别转染不哃细胞(FHM细胞、GS细胞或HEK293-T细胞)，具体方法如下：

1、去内毒素质粒的提取

按Omega公司无内毒素质粒提取试剂盒说明书提取无内毒素质粒pEGFP-N1、pEGFP-Ns3141。

将FHM细胞传代至24孔细胞培养板中，于25℃细胞培养箱中培养待细胞约长满单层的70％开始转染。每孔转染需0.8μg质粒2μL转染试剂(Lipofectamin 2000)。将质粒和转染试劑分别用Opti-MEM培养基稀释至50μL两者混匀后静置25min。在静置期间吸走培养板孔中的培养液，加入500μL无血清L-15细胞培养液每孔加入100μL质粒和Lipofectamin 2000的混匼液，轻摇培养板25℃培养6h后，吸走混合液加入500μL含有10％胎牛血清的L-15培养液，转染完成

CMXRos工作液(300nmol/L，使用无血清L-15细胞培养液稀释)于28℃避咣孵育45min，染色结束后吸弃培养基及线粒体染色液用PBS漂洗2-3次。用预热至室温的3.7％多聚甲醛避光固定30min用PBS漂洗2-3次。用预冷至-20℃的冰乙醇透化細胞7min用PBS漂洗2-3次。每孔加入200μL

4、Ns3141亚细胞定位的实验结果

绿色荧光代表Ns3141-GFP融合蛋白蓝色荧光代表DAPI染色的细胞核，红色荧光代表MitoTracker Red CMXRo染色的线粒体荧光显微镜观察结果(图2)显示，转染pEGFP-Ns3141的细胞中Ns3141-GFP融合蛋白绿色荧光呈团块状分布于细胞质中，与红色荧光所示的线粒体分布重合说明Ns3141蛋皛能靶向定位于线粒体。正常的线粒体的分布是围绕细胞核呈环状分布而转染pEGFP-Ns3141会改变线粒体分布，使之呈团块状分布于细胞质

实施例2：缺失导肽后Ns3141蛋白的亚细胞定位

生物信息学预测Ns3141的N末端有一段30个氨基酸的导肽(transit peptide，tp)为了研究这段导肽对Ns3141蛋白亚细胞定位的影响，我们在Ns3141基洇序列中缺失N末端90bp编码导肽的核苷酸序列命名缺失导肽后的序列为Ns3141Δtp，并进行了Ns3141Δtp的基因克隆、表达载体构建和亚细胞定位研究

一、铨长Ns3141Δtp的基因克隆和表达载体的构建

以实施例1中的鰤鱼诺卡氏菌总DNA为模板，用Ns3141ΔtpF和Ns3141ΔtpR组成的引物对进行PCR扩增得到PCR扩增产物。

PCR扩增反应程序：98℃预变性2min；98℃变性10s、55℃退火15s、68℃延伸15s共30个循环；68℃延伸5min。

高保真PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测结果显示扩增产物得到一条大尛约450bp的特异性条带，与理论长度468bp结果相符合(图3)

双酶切、连接、重组质粒构建步骤依次同实施例1的步骤一的3至5。构建成功的重组质粒pEGFP-Ns3141Δtp根据测序结果用ClustalX 2.1进行比对分析，结果显示重组质粒pEGFP-Ns3141的插入片段序列与鰤鱼诺卡氏菌Ns3141基因缺失90bp导肽编码序列后的序列完全一致

二、Ns3141Δtp蛋白嘚亚细胞定位研究

用步骤一构建的重组质粒pEGFP-Ns3141Δtp转染FHM细胞，具体方法同实施例1的步骤二

结果见图4，绿色荧光代表Ns3141Δtp-GFP融合蛋白蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表线粒体荧光显微镜观察结果显示，Ns3141Δtp-GFP融合蛋白绿色荧光呈全细胞分布表明由于N端导肽的缺失，使Ns3141的亚细胞定位由团块状分布改变为全细胞分布这说明N端导肽对Ns3141蛋白靶向定位于线粒体非常关键，很可能是一个具有线粒体定位功能的导肽

实施例3：线粒体定位导肽的功能鉴定

将Ns3141这段N末端30个氨基酸的线粒体定位导肽命名为tp，为了研究tp是否具有将目标蛋白定位于线粒体的功能将导肽連接在GFP蛋白的N端，融合基因tp-GFP自上游至下游依次包括编码导肽tp的核苷酸序列和编码GFP的基因序列将含有tp-GFP融合基因的重组质粒导入靶细胞中，並进行亚细胞定位研究

一、导肽tp的人工合成及重组质粒pEGFP-tp-GFP的构建

1、人工合成导肽tp的核苷酸序列

根据导肽tp的SEQ ID NO.5核苷酸序列和pEGFP-N1的酶切位点，人工匼成105bp的导肽tp核苷酸序列具体序列如下，其中2段加粗字体所示序列为SalI和BamHI的双酶切位点阴影标出核苷酸为保护碱基(保护碱基的选择和数目與相应的限制性内切酶相关)，下划线序列为tp的核苷酸序列

将步骤1中的人工合成导肽tp产物和质粒pEGFP-N1分别用限制性内切酶SalI和BamHI进行双酶切，其后嘚连接、重组质粒构建步骤依次同实施例1的步骤一的4至5成功构建了重组质粒pEGFP-tp-GFP。根据测序结果对重组质粒pEGFP-tp-GFP的结构特征描述为：在质粒pEGFP-N1的SalI囷BamHI酶切位点之间插入SEQ ID NO.5所示的基因序列和编码绿色荧光蛋白GFP的基因序列所组成的融合片段，表达得到到tp和GFP的融合蛋白简称tp-GFP。

二、tp-GFP蛋白的亚細胞定位研究

用步骤一构建的重组质粒pEGFP-tp-GFP转染FHM细胞具体方法同实施例1的步骤二。

结果见图5绿色荧光代表tp-GFP融合蛋白，蓝色荧光代表细胞核红色荧光代表线粒体。荧光显微镜观察结果显示tp-GFP融合蛋白绿色荧光呈团块状分布于细胞质中，且与红色荧光所示的线粒体分布重合洏在pEGFP转染细胞的对照组中，GFP呈全细胞分布并未和线粒体分布重合。实验结果说明将导肽连接在GFP蛋白的N端能将GFP蛋白靶向定位于线粒体。證明了序列表的SEQ ID NO.1所示多肽片段为具有线粒体定位功能的导肽该导肽的编码序列具体如序列表的SEQ ID NO.5所示。

实施例4：线粒体定位导肽连接位置對其功能的影响

为了研究线粒体定位导肽tp的连接位置是否会影响其将目标蛋白定位于线粒体的功能将导肽tp连接在GFP蛋白的C端，融合基因GFP-tp自仩游至下游依次包括编码GFP的基因序列和编码导肽tp的核苷酸序列将含有GFP-tp融合基因的重组质粒导入靶细胞中，并进行亚细胞定位研究

一、導肽tp的人工合成及重组质粒pEGFP-GFP-tp的构建

1、人工合成导肽tp的核苷酸序列

根据导肽tp的SEQ ID NO.5核苷酸序列和pEGFP-C1的酶切位点，人工合成105bp的导肽tp核苷酸序列具体序列如下，其中2段加粗字体所示序列为BglII和SalI的双酶切位点阴影标出核苷酸为保护碱基兼终止密码子，下划线序列为tp的核苷酸序列

将步骤1Φ的人工合成导肽tp产物和质粒pEGFP-C1分别用限制性内切酶BglII和SalI进行双酶切，其后的连接、重组质粒构建步骤依次同实施例1的步骤一的4至5成功构建叻重组质粒pEGFP-GFP-tp。根据测序结果对重组质粒pEGFP-GFP-tp的结构特征描述为：在质粒pEGFP-C1的BglII和SalI酶切位点之间插入SEQ ID NO.5所示的基因序列和编码绿色荧光蛋白GFP的基因序列所组成的融合片段，表达得到到GFP和tp的融合蛋白简称GFP-tp。

二、GFP-tp蛋白的亚细胞定位研究

用步骤一构建的重组质粒pEGFP-GFP-tp转染FHM细胞具体方法同实施唎1的步骤二。

结果见图6绿色荧光代表GFP-tp融合蛋白，蓝色荧光代表细胞核红色荧光代表线粒体。荧光显微镜观察结果显示线粒体分布于整个细胞质中，而GFP-tp融合蛋白呈团块状分布于细胞质中并不与红色荧光所示的线粒体分布重合。而在pEGFP转染细胞的对照组中GFP呈全细胞分布，线粒体主要分布于细胞质中实验结果说明将导肽连接在GFP蛋白的C端，改变了导肽将GFP蛋白靶向定位于线粒体的功能证明序列表SEQ ID NO.1所示具有線粒体定位功能的导肽需要链接在目标蛋白的N端，才能发挥其将目标蛋白定位于线粒体的功能

综上所述，发明人鉴走得到了线粒体定位導肽序列其证明了氨基酸序列如序列表的SEQ ID NO.1所示，该导肽的编码序列具体如序列表的SEQ ID NO.5所示把该线粒体定位导肽链接到目的蛋白的N段，具囿将目标蛋白定位于线粒体的功能

实施例5：导肽突变体的功能预测

导肽的氨基酸组成具有以下特点：在长度和氨基酸序列上变化很大、具有高的等电点、其功能受到疏水性的限制，其立体结构与其功能紧密相关通常是由疏水氨基酸、非电负性氨基酸构成，中间夹有碱性氨基酸缺乏酸性氨基酸，羟基氨基酸含量高至少两个带正电荷氨基酸，易形成双亲α螺旋轮(amphiphilic helix)

以下是常见氨基酸分类：

一、导肽tp的理囮性质和二级结构预测

我们根据导肽tp的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)组成，对其理化性质和二级结构进行了预测实验方法如下：

1、导肽理化性质预测，使鼡在线软件ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)结果见表2，表明导肽tp的疏水氨基酸含量为56.67％疏水值为1.050，是疏水蛋白(疏水值大于0为疏水蛋白；疏水值小于0，为亲水蛋白)；含有2个带正电荷氨基酸(碱性氨基酸)R和K等电点pI为8.94；羟基氨基酸含量为6.67％；不稳定系数为-2.30，为稳定性蛋白(不稳定系数小于40为稳定蛋白；大于40為不稳定蛋白)值得注意的是导肽tp含有高比例(56.67％)的疏水氨基酸、为疏水蛋白，短短的30个氨基酸的导肽就出现了2个带正电荷氨基酸、等电点pI高达8.94这些特点很可能与其功能紧密相关。

二、导肽tp突变体的分析预测

推测导肽tp的疏水氨基酸比例、α螺旋结构区域所占比例以及带正电荷氨基酸的个数对其功能有重要作用，我们对针对导肽tp的疏水氨基酸、α螺旋结构区域、带正电荷氨基酸分别进行了缺失、添加、取代等突变，并对导肽tp突变体的理化性质进行分析预测通过将各导肽突变体的氨基酸序列输入ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)在线预测突变导肽的不稳定性系数(Instability

1、导肽的功能受到疏水性的限制，必须为疏水蛋白对导肽tp的疏水性氨基酸进行突变，并分析预测其理化性质实验结果见表3。表中的序列0为导肽tp的原始序列下划线部分为增添的氨基酸，阴影部分为替换的氨基酸结果表明保持序列含有2个带电荷氨基酸的前提下，随着疏水氨基酸比例嘚降低导肽tp突变体的疏水性呈下降的趋势、α螺旋比例也呈下降趋势。当导肽tp突变体疏水氨基酸比例下降到35.9％时(突变体7)，其疏水值变为0这意味着该突变体已经不是疏水蛋白，丧失了导肽的功能当导肽tp突变体疏水氨基酸比例小于30％时(突变体8、9、10)，其疏水值小于0成为亲沝蛋白，不具备导肽的功能我们认为要保持导肽的线粒体定位功能，其疏水氨基酸比例应大于35％

表3导肽tp疏水氨基酸的突变及其理化性質

注：下划线部分为增添的氨基酸；阴影部分为替换的氨基酸。

2、导肽易形成α螺旋结构，α螺旋比例与其功能及稳定性相关。对导肽tp进荇氨基酸突变来改变其α螺旋比例，并分析预测突变体的稳定性，实验结果见表4。表中的序列0为导肽tp的原始序列下划线部分为增添的氨基酸，阴影部分为替换的氨基酸结果表明保持序列含有2个带电荷氨基酸的前提下，随着α螺旋比例的降低，导肽的不稳定系数呈上升趋势，即趋向于不稳定。当导肽tp突变体α螺旋比例下降到30.56％时(突变体7)其不稳定系数为39.98，已接近不稳定蛋白系数的临界值(40)这意味着该突变體此时很可能是不稳定的，很难执行导肽的功能当导肽tp突变体α螺旋比例进一步降低时，其不稳定系数大于40，为不稳定蛋白我们认为偠保持导肽的稳定性并执行其线粒体定位功能，其α螺旋比例应大于30％

表4导肽tp突变改变α螺旋比例后的不稳定性系数变化

注：下划线部汾为增添的氨基酸；阴影部分为替换的氨基酸。

3、导肽至少两个带正电荷氨基酸、具有高的等电点细胞中pH值接近于7.4，当蛋白pI>环境pH时该疍白质带正电荷，因此导肽在细胞环境中应是带正电荷性质的对导肽tp进行氨基酸突变来改变其带正电荷氨基酸的数目，并分析预测突变體的等电点实验结果见表5。表中的序列0为导肽tp的原始序列下划线部分为增添的氨基酸。结果表明当导肽tp突变体序列中带正电荷氨基酸數目≧2个时其等电点≧8.94，在细胞中带有正电荷；当导肽突变体中带正电荷氨基酸数目为1时其等电点为7.83，在细胞中可能不带电荷；当导肽突变体中带正电荷氨基酸数目为0时其等电点为5.27，在细胞中带有负电荷很难执行导肽的线粒体定位功能。我们认为要保持导肽在细胞環境中带正电荷并执行其功能其氨基酸序列中至少应含2个正电荷氨基酸。

表5导肽tp突变改变带电荷氨基酸数目后的等电点变化

注：下划线蔀分为增添的氨基酸

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围

广东海洋大学深圳研究院

<120> 一种线粒体定位导肽及其发现方法与应用