(2)扩增曲线断裂或下滑
(3)个别扩增曲线骤降
这是比较常见的一个问题,反应管内若留有气泡,温度升高后会导致气泡破裂,使仪器检测到的荧光值突然降低。所以进行扩增反应之前,一定要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
(4)扩增曲线呈锯齿状且不连续
预变性时间至少 5 min,如果是高 GC 的模板,可以延长预变性时间至 10 min,预变性时间不够,会导致酶活未完全释放,酶活释放不好,那扩增效率肯定就不行啦,所以大家在用 qPCR 试剂的时候,一定要注意分辨热启动酶的封闭手段。
(6)反应结束无扩增曲线出现
(1)杂峰在主峰之前,Tm 约为 70-75℃——一般为引物二聚体