肝素—超氧化物歧化酶结合物（Hep-SOD）防治辐射损伤作用的研究--《山东大学》2013年硕士论文
肝素—超氧化物歧化酶结合物（Hep-SOD）防治辐射损伤作用的研究
【摘要】：随着医疗技术的快速发展,日益精密先进的放射疗法在肿瘤治疗领域发挥着举足轻重的作用。然而,肿瘤周围的正常组织损伤始终是一个无法根本克服的难题,很大程度上阻碍了放疗的进一步深化应用。为了有针对性地研究出高效低毒的辐射保护剂,首先需要了解辐射损伤的产生机理。目前被广泛接受的是一种氧化应激损伤学说,该学说认为辐射作用于机体后,诱导体内产生过量活性氧类物质(reactive oxygen species, ROS),后者靶向损害DNA、脂质、蛋白质等生物大分子进而引起相关组织功能异常,产生损伤效应。其中,ROS家族包含了多个成员,超氧自由基(superoxide radical, O2)最先产生并通过后续反应可诱发多种其它ROS。可见,清除O2-缓解辐射损伤起着关键作用。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)是体内唯一特异性歧化O2-的酶,但是其直接药用存在易降解、稳定性差、半衰期短等不足。为提高此类酶类药物在体内的生物利用度,化学修饰是常用的方法之一。我们在此采用功能性黏多糖肝素作为修饰剂,旨在改善蛋白质药物的自身不足,同时也能整合多种生物学功能,从而协同其药效的发挥。本课题中,我们借鉴前人研究基础,先后分离纯化SOD原料并制备出肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)。通过SDS-PAGE、Native-PAGE、SEC-HPLC、连苯三酚自氧化速率测定法及凝胶渗透色谱-多角度激光散射技术检测SOD及Hep-SOD的纯度、酶比活、分子量等。运用优化的MTT法于体外初步评价Hep-SOD对小鼠肺成纤维细胞L929的辐射防护作用。采用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性和Hep-SOD的基本药代动力学参数。参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,在小鼠全身水平开展Hep-SOD对辐射损伤防护作用的体内评价。
1.猪血SOD原料的分离纯化
借鉴前人研究基础,采用DEAE-Sepharose Fast Flow对猪血SOD原料进行分离纯化。联合SDS-PAGE和SEC-HPLC对SOD纯化产品进行纯度的定性和定量检测。结果表明DEAE-Sepharose Fast Flow一步法可将SOD的纯度由87%提高到100%左右。联合BCA蛋白定量和微量连苯三酚自氧化速率法测定活性,纯化后SOD的酶比活由3076u/mg prot提高到4614u/mg prot。
2.肝素修饰SOD结合物(Hep-SOD)的制备及其纯度和分子量的测定
借鉴前人研究基础,先后经过肝素活化、结合反应及Q-Sepharose Fast Flow分离纯化制备Hep-SOD。采用三硝基苯磺酸法(TNBS法)检测出SOD的平均自由氨基修饰率为32%。通过SDS-PAGE和Native-PAGE检测,发现分离纯化出两种修饰率不同的Hep-SOD,分别为Hep-SOD1和Hep-SOD2。与未修饰SOD相比,Hep-SOD1酶比活保留率为68%,Hep-SOD2的酶比活保留率为40%。借助凝胶渗透-多角度激光散射技术,测得两者的重均分子量(Mw)分别为49.69kDa和61.07kDa。
3. Hep-SOD对小鼠L929细胞辐射防护作用的体外评价
先后对L929细胞接种密度、产生敏感性照射剂量及照射后检测时间进行筛选,结果表明L929按每孔2000个细胞进行接种,于照后48h进行MTT检测,可对4Gy的X射线产生显著的辐射敏感性。同时,Hep-SOD用药剂量的筛选结果显示：可能源于较高的肝索修饰率,Hep-SOD2的安全剂量范围较窄,仅在500～0μg/ml(即112.5～0U/m1)范围无细胞毒作作用；而Hep-SOD1在考察的剂量范围1000～0μg/ml(即990～0U/m1)内均无细胞毒作用。为方便比较,我们统考察112.5U/ml的Hep-SOD1和Hep-SOD2分别在照前给药和照后给药对L929细胞的辐射防护作用。结果表明：二者照前给药的防护作用突出,相对细胞活力与正常对照组相比无显著差异；而照后给药则无此作用。
4. Hep-SOD在小鼠体内基本药代动力学参数的测定
对小鼠采用腹腔注射，于给药后不同时间点采血,利用总SOD测试盒检测小鼠外周血中酶活性,并结合相关软件分析。结果表明：Hep-SOD在小鼠体内药动学行为符合二室模型；Hep-SOD1和Hep-SOD2较术修饰SOD体内半衰期均显著延长,尤其是Hep-SOD2的平均滞留时间(MRT)由SOD的(10.28±0.98)h显著延长到了(22.86±3.37)h,表现出更高的生物利用度逆。
5. Hep-SOD对小鼠辐射防护作用的体内评价
基于Hep-SOD体外评价和基本药代动力学参数的测定结果,在此着重选择具备一定辐射防护效果和较高生物利用度的Hep-SOD2(为简便起见,下文更换名称为Hep-SOD)进行本章的体内药效评价。具体参考抗辐射药物的临床前试验指导原则,系统考察Hep-SOD在受照小鼠全身水平的辐射防护作用。结果显不：Hep-SOD可有效缓解辐射诱发的骨髓抑制；预防组织器官(尤其是肺组织)的氧化应激损伤；阻止辐射导致的外周血谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的异常升高；减轻小鼠肝组织、肺组织及小肠组织的结构病变；整体表现较好的辐射损伤防护作用。但胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示照前给药有加剧DNA损伤的可能。综上可知,我们对辐射损伤的产生和Hep-SOD防护作用机理的认识还有待进一步加深。
本研究取得结果和结论：
(1)运用凝胶渗透-多角度激光散射光谱技术测得Hep-SOD重均分子量。
(2) Hep-SOD于照射前给药对小鼠肺成纤维细胞L929可表现较好的辐射损伤防护作用。
(3)SOD经肝素化修饰后体内保留时间显著延长,生物利用度明显提高；且随其自由氨基修饰率的提高,Hep-SOD表现更好的药代动力学性质。
(4)在小鼠辐射损伤模型试验中,Hep-SOD可有效减轻辐射诱发的骨髓抑制,缓解肝组织和肺组织的氧化应激损伤,且抑制肝、肺和小肠的病理形态变化。但是,结果同样显示Hep-SOD照射前给药可能加剧DNA损伤,这为我们全面研究辐射损伤的产生及Hep-SOD的作用机制指明了新的方向。
【关键词】：
【学位授予单位】：山东大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：R818.05;R96【目录】：
摘要16-19ABSTRACT19-23符号说明23-26第一章 前言26-39 1 活性氧类物质(reactive oxygen species,ROS)26 2 辐射与辐射损伤26-28 3 辐射保护剂的研究28 4 超氧化物歧化酶(SOD)及其辐射保护作用的研究28-34
4.1 超氧化物歧化酶28-30
4.2 SOD的辐射保护作用研究30-34
4.2.1 组织或器官水平的辐射保护作用30-31
4.2.2 细胞水平的辐射保护作用31-33
4.2.3 分子水平的辐射保护作用33-34 5 超氧化物歧化酶的自身局限性与解决办法34-35
5.1 SOD的自身局限性34
5.2 改善SOD不足的解决办法34-35
5.2.1 转基因治疗34
5.2.2 非肽模拟类似物34-35
5.2.3 化学修饰35 6 肝素修饰SOD的可行性35-38
6.1 肝素的生物活性35-37
6.1.1 抗血栓36
6.1.2 抗炎36-37
6.1.3 降血脂37
6.1.4 抗癌37
6.1.5 抗氧化37
6.2 前期研究基础37-38 7 本课题拟解决问题38-39第二章 超氧化物歧化酶原料的分离纯化39-48 1 材料39-40
1.1 试剂39
1.2 仪器39-40 2 方法40-42
2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶色潜柱对SOD的分离纯化40
2.2 样品的超滤脱盐40
2.3 SOD的SDS-PAGE检测40-41
2.4 SOD的SEC-HPLC检测41
2.5 SOD的蛋白质含量测定41
2.6 SOD的酶活测定41-42 3 结果42-45
3.1 SOD的分离纯化42-43
3.2 SOD的SDS-PAGE分析43
3.3 SOD的SEC-HPLC检测43-44
3.4 SOD的酶活检测44-45 4 讨论45-47
4.1 SOD的分离纯化45
4.2 蛋白含量测定方法的选择45-46
4.3 酶活测定方法的选择46-47 5 结论47-48第三章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)的制备及其纯度与分子量的测定48-61 1 材料48-49
1.1 试剂48
1.2 仪器48-49 2 方法49-51
2.1 肝素的活化49
2.2 肝素与SOD的结合反应49
2.3 SOD平均自由氨基修饰率的测定49
2.4 Q-Sepharose Fast Flow凝胶色谱柱对Hep-SOD的分离纯化49-50
2.5 样品的超滤脱盐50
2.6 Hep-SOD的电泳检测50
2.7 Hep-SOD的分子量检测50-51
2.8 Hep-SOD的酶活测定51 3 结果51-57
3.1 SOD平均自由氨基修饰率51
3.2 修饰反应液的电泳检测51-52
3.3 修饰反应液的分离纯化52
3.4 修饰反应液分离纯化产物的Native-PAGE52-53
3.5 Hep-SOD分子量测定53-57
3.5.1 纯化SOD的多角度激光散射图谱53-54
3.5.2 肝素的多角度激光散射图谱54-55
3.5.3 Hep-SOD的多角度激光散射图谱55-57
3.6 Hep-SOD酶活测定57 4 讨论57-60
4.1 肝素对SOD的化学修饰57-58
4.2 Hep-SOD的分离纯化58-59
4.3 肝素化修饰对SOD活性的影响59
4.4 Hep-SOD分子量分布59-60 5 结论60-61第四章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)辐射防护作用的体外研究61-69 1 材料61-62
1.1 试剂61
1.2 细胞株61
1.3 仪器61-62 2 方法62-64
2.1 L929细胞的传代及培养62
2.2 MTT法评价Hep-SOD对L929细胞的辐射防护作用62-64
2.2.1 细胞接种密度、敏感性照射剂量及照后检测时间的筛选62
2.2.2 Hep-SOD用药剂量的筛选62-63
2.2.3 Hep-SOD对L929细胞辐射防护作用的评价63-64
2.2.3.1 照前给药作用评价63
2.2.3.2 照后给药作用评价63-64
2.3 数据处理64 3 结果64-68
3.1 细胞接种密度、敏感性照射剂量及照射后检测时间的筛选64-65
3.1.1 照后24h检测结果64
3.1.2 照后48h检测结果64-65
3.2 药物剂量的筛选65-66
3.3 药物辐射防护作用评价66-68 4. 讨论68 5 结论68-69第五章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)基本药代动力学参数的测定69-74 1 材料69-70
1.1 试剂69
1.2 仪器69
1.3 动物69-70 2 方法70
2.1 抗凝EEP管制作70
2.2 动物分组、给药及取血70
2.3 小鼠外周血浆酶活测定70
2.4 数据处理70 3 结果70-72 4 讨论72 5 结论72-74第六章 肝素-超氧化物歧化酶结合物(Hep-SOD)防治辐射损伤体内药效评价74-88 1 材料74-75
1.1 试剂74
1.2 仪器74-75
1.3 动物75 2 方法75-77
2.1 动物分组75
2.2 小鼠急性辐射损伤模型75
2.3 生化指标测定75-76
2.3.1 器官指数75
2.3.2 造血功能指标75-76
2.3.2.1 脾结节(CFU-S)计数75
2.3.2.2 骨髓有核细胞(BWNC)计数75
2.3.2.3 骨髓DNA含量测定75-76
2.3.3 外周血象计数76
2.3.4 肝功检测76
2.3.5 组织抗氧化能力检测76
2.3.6 胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳76
2.3.6.1 胸腺DNA的提取76
2.3.6.2 DNA琼脂糖凝胶电泳76
2.3.7 病理切片观察76
2.4 数据处理76-77 3 结果77-84
3.1 器官指数77
3.2 造血功能77-78
3.3 外周血象计数78-79
3.4 肝功检测79
3.5 组织抗氧化能力检测79-81
3.5.1 MDA检测79-80
3.5.2 GSH检测80-81
3.6 胸腺DNA琼脂糖凝胶电泳81-82
3.7 组织病理切片观察82-84
3.7.1 肝组织病理切片观察82-83
3.7.2 肺组织病理切片观察83-84
3.7.3 小肠组织病理切片观察84 4 讨论84-87
4.1 Hep-SOD对骨髓抑制的调控84-85
4.2 Hep-SOD对氧化应激的调控85-86
4.3 Hep-SOD对肺损伤的保护作用86-87 5 结论87-88全文总结88-89参考文献89-104致谢104-105攻读硕士学位期间发表的学术论文105-106学位论文评阅及答辩情况表106
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【创业项目】中科院耐热sod酶&电话&企业精神&&博大&&明德&&务实&&创新企业宗旨&&做健康产业&&做一流产品企业核心价值观&&臻于至善&&农业兴邦员工价值观&&同心筑梦&&让世界感动管理理念&&执行力是第一生产力人才理念&&德才兼备&&知行合一企业愿景&&发展农业产业&&铸造国际品牌&&&&耐热超氧化物岐化酶—SOD　　产品说明：　　超氧化物歧化酶（SOD）是专一清除体内致病因子——超氧阴离子自由基的金属酶，自由基是导致人体疾病和衰老的元凶，从而提高人体免疫力，使各脏器不受自由基损伤，起到抗衰老、抗辐射、抗炎和抗癌等功效。　　&耐热超氧化物歧化酶（SOD）是国家十五、十一五“863”重大课题项目（课题编号：，），由中国科学院国家重点实验室采用先进生物发酵技术，历时八年开发出来的新一代SOD酶产品（产品技术专利号：ZL.9）。　　生物发酵提取的Fe-SOD，化学稳定性好，安全性高，体内半衰期长达7小时，且活性不受催化产物H2O2的抑制(Cu、Zn-SOD和Mn-SOD受H2O2浓度的抑制)，与人无交叉感染，无过敏性反应等优点。&　　耐高温SOD的应用研究很广泛，可归纳以下几方面：　　1．清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象，即延缓皮肤衰老和脂褐素沉淀的出现。　　2．提高人体对自由基损伤而诱发疾病的抵抗力，包括对肿瘤、炎症、肺气肿、白内障和自身免疫疾病等有显著的抵抗作用。　　3．提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，如烟雾、辐射、有毒化学品和有毒药品等，增强机体对外界环境的适应能力。　　4．清除机体疲劳，增强对超负荷大运动量的适应力。　　产品特点：　　1．生物发酵提取，无血液病毒及交叉感染危险；　　2．耐热性强，90℃&环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分钟酶活保持90％以上；　　3．稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定，在常温下保存两年酶活维持在95％以上；　　这样的SOD酶制剂在世界独一无二；　　4．分子量小，容易被吸收；　　5．生物利用度高。　　注：　　发明单位：中国科学院微生物研究所　　超氧化物岐化酶的产品在中国的批号　　SOD是中国卫生部批准的具有延缓衰老功能的物质之一。&　　法定编号:ECI.15.1.1&　　CAS:&　　SOD功效中国卫生部批准文号：&　　抗衰老：97-748，98-81&　　免疫调节：97-221，97-598&　　调节血脂：97-9，97-267&　　美容：97-795&　　抗辐射：97-697　　世界各国对“SOD”的作用认定：&　　美国注册专利号为（CN1152337A）：用于预防和治疗大脑局部出血、溃疡、消除炎症、心率失常、浮肿、中毒、风湿、类风湿、风湿性关节炎、放射性损伤、药物中毒等症。　　法国注册专利号为（CN1167441A）：用于预防和治疗特异性脑损伤、非特异性脑损伤而引起的脑功能识别障碍。　　欧洲注册专利号为（499621）：用于预防和治疗癌症及术后放、化疗带来的脑损伤，抑制癌细胞再形成或扩散。　　日本注册专利号为（12533）：用于治疗器官移植后的抗免疫反应具有奇效。用于治疗大脑局部出血导致神经坏死，防止半身不遂的治疗药物。　　台北医院用“SOD”治疗烧伤、烫伤、比较实验获得成功，报道说：用“SOD”涂抹患处愈合是常规疗法的3倍，而且疤痕明显减轻。　　美国休斯顿得克萨斯大学的安德森，癌症中心的华人博士黄鹏和他的同事们发现SOD可以选择性地杀灭白血病细胞，而不损害正常组织细胞。　　世界第一科学家欧文戴维斯（三次诺贝尔奖获得者）得出以下结论：　　“美国，由于SOD的药用及临床应用，SOD类食品已开始被人们广泛食用，美国人的健康水平因而得到进一步的提高，十年后美国人的平均寿命可达到95岁”（摘自国家信息情报中心）。　　注：美国人现在的平均寿命75岁，若活到95岁得多活20年。&
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　　【白癜风康复案例描述】
　　白癜风是一种较为常见的皮肤病，以皮肤白斑性损害为主要临床症状，尤其是面部白斑最为严重，而由于很多患者在早期对病情的不了解，导致了病情的加重，让那些白癜风患者承受着心灵和身体上的双重伤害，20岁一个花一样年龄的河北女孩小云却被白癜风折磨的不敢照镜子，也不敢出门见人，她是一个生活在白癜风阴影里的典型例子。
　　【白癜风康复案例解读】
　　在2012年，小云在参加一次同学聚会以后，由于饮食问题而使得嘴部出现了过敏的情况。期间通过相应的治疗调理，其过敏症状得到了十分有效地控制，不过，由于后期调理措施不当，却使得过敏带来的皮肤损伤在嘴角形成了一些小白斑。起初小云认为是皮肤恢复而出现的正常变化，为了遮盖这块白斑，经常在出门前盖上一层厚厚的妆，并没有过多的在意，孰不知，这样做埋下了很深的隐患。随着时间的推移，这些白点不但没有消退，甚至还越变越大。后来听邻居说北京美迪中医皮肤病医院治疗皮肤病不错，小云就在家长的陪同下，来到北京美迪中医皮肤病医院接受了检查，通过八大特色检测：三维皮肤CT扫描、黑色素抗体检测、酪氨酸酶抗体检测、铜蓝蛋白检验微量元素检验、Wood灯检查、免疫功能检查、耐药性检测对其进行诊断，最后经权威专家确诊为白癜风。在随后的调理过程中，为了防止其病症的继续扩散，专家对小云进行了“SOD血液6+1祛白技术”，它是由国务院津贴专家领衔的团队经过长期的临床研究，在总结古代经方、验方的基础上，结合现代科技独创，该体系是由八大特色检查和五大核心技术组成，通过查找病因――ZT净血技术，排毒净血――超导生物电磁技术，排出细胞毒素――提取激活技术，确保细胞质量――特色组方，重树机体免疫，根据小云的自身体质，采取最佳的治疗组合，解决了小云脸上的白癜风久治不愈、反复发作的难题。该体系是目前国际上最先进的技术。
　　【康复过程】
　　由于患者小云的白斑病症是由于自身过敏反应而引起，因此，其自身免疫功能可能还存在一定的异常。所以，在进行病症的治疗前，专家还通过相应的免疫功能检测，判断了小云可能出现的免疫紊乱情况。在确保其影响不会阻碍治疗后，对其病症进行了治疗。由于小云乐观开朗，而且脸部的白斑面积还没有发展，比较稳定，因此，小云的治疗的效果也十分的明。随后，小云又继续接受治疗了一段时间，来巩固病情，终天小云可以自信的照镜子了，也可以拿手机玩自拍了，小云说她自己很幸运，听了邻居的一句话，抱着将信将疑的态度，来到了北京美迪中医皮肤病医院，是这里医生的精湛技术和护士无微不至的关怀给了她希望，给她的白色世界添上了色彩，让她的生活不再因脸上的白斑而羞于见人。
　　【白癜风有哪些特点】
　　一、白癜风在生活中困扰着患者，对人们的外貌就产生直接的影响，让患者朋友在生活中处于自卑的情绪，给患者心理带来深深的打击，同时白癜风对患者的皮肤更是伤害甚深。
　　二、白癜风在生活上和正常的人们是不一样的，不管是从饮食方面，还是工作方面，有一定的区别，白癜风患者工作机会远远没有正常人的工作机会大，一个人的形象也是很重要的。
　　三、患者如果患白癜风时间长了，就有可能会引起其他疾病的产生，晚期的白癜风不但对身体健康严重威胁，在治疗方面也是有一定困难，所以白癜风患者要早发现早治疗，只有这样才是最佳的方法。
　　四、白癜风很容易让患者的皮肤产生皮肤癌，患者在烈日的照射下，产生大量的黑色素对皮肤的伤害可以说是非常严重的，所以患者在生活中还要常常的蔽日，秋冬季节白癜风患者一般病情是比较好治疗的，在春夏季节是白癜风发病的高峰期，所以就更应该加以护理。
　　以上的几点就是白癜风的一些病情特点的介绍，专家提醒白癜风给患者的身心带来极大的伤害，所以提醒大家一定要在日常做好预防工作。
　　【温馨提示】
　　“SOD血液6+1祛白技术”以循证医学为基础，以国际临床诊疗为指导，结合现代医学理论，突出传统中医特色建立的SOD血液6+1祛白技术。该疗法首先采用自体净血技术、有效清除血液中的有害物质、改善血液质量、增强血液微循环，实现排毒净血。其次，超导生物电磁技术，能有效清除黑色素细胞中的毒素，恢复黑色素细胞活性。再通过秘制中药把人体储备在皮肤深层的黑色素细胞提取至表皮层，结合光能激活，使黑色素细胞分泌增值、增加黑色素细胞数量，使大量黑色素细胞能分泌、再生黑色素消除白斑。最后采用中医中药特色组方，固本培元，达到抵御复发之功效。
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