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【求助】做荧光定量PCR扩增效率很低是为什么?
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这个帖子发布于9年零349天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
扩增曲线总是上不去,在一个较低的水平就到平台了,而且融解曲线的峰也很低,很少能上0.10以上.连内参GAPDH也是,怎么回事啊?25 ul 体系用了2ul的摸板和2l的引物,是不是太高了?
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　　太高了吧，我一般只加１ul模板和０.５ul的引物
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模版有问题，建议你纯化一下模版。而且模版加的太多了。
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可能是模版提取过程中残留的抑制PCR反应的物质在起作用，建议你把模版稀释几倍试试。引物量要适当，一般在0.1~0.2微摩。
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可能一:模板浓度太高了.模板总量一般不超过100ng可能二:引物太多了,终浓度0.2uM就可以了,也就是10pmol/ul的引物只需0.5ul就可以了.
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模板可能含有不纯杂质，会影响扩增效率。另外，你加的模板浓度也高了点，少加点。
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各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！
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尹女士 各位大侠：我在做PCR时也遇到扩增效率不高的问题，我的模板是从肠道内容物中用酚－氯仿提取法提取细菌的DNA，请问这种模板应该如何纯化处理呢？谢谢！建议用氯仿再抽提，不要加酚。
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引物和探针100uM，各0.1uL就OK了:8)
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模板是否太多不好说，因为不知你作反转录时tRNA用了多少，所以不大同意上面几位战友的意见，我在其他的试剂盒说明书里曾看到每２０体系里可以加入200ng tRNA，我认为扩增效率不高可能是因为你的tRNA提的不好，不知你目的基因的长度是多少，建议你重新提取RNA，再试试吧，这就是科学工作的意义。
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erxiao 扩增曲线总是上不去,在一个较低的水平就到平台了,而且融解曲线的峰也很低,很少能上0.10以上.连内参GAPDH也是,怎么回事啊?25 ul 体系用了2ul的摸板和2l的引物,是不是太高了?单独看楼主的叙述不好下确定的结论,但是有几点建议给你:1 在看溶解曲线说明你的显色系统是染料,那你首先要确定你扩出来的产物是不是你要的特异性条带,建议先不加染料,做定性跑胶看看,另外要仔细分析溶解曲线;2 扩增曲线只是平台低,那还可能是荧光信号显示或检测的效率问题,看看你染料的质量,仪器的保养等等,如果PCR扩增效率的问题,经常表现是Ct值也要靠后;3 至于体系配制,你没有给出浓度,实在无从谈起,但是开始做的时候,一般中规中矩就可以了.
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学习中。。
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【求助】求助:荧光定量（相对定量）目的基因扩增效率低为什么？
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这个帖子发布于4年零248天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
SYGR相对荧光定量PCR，打算用2-△△ct法进行定量，即要求内参基因和目的的基因的扩增效率基本一致，接近100%,目前我设计了一个目的基因的引物，根据普通PCR的温度梯度选择了合适的退火温度，跑荧光定量PCR，并按照2倍浓度稀释的方法计算扩增效率，按照浓度梯度稀释得到的扩增曲线：溶解曲线：但是计算得到的扩增效率比较低，计算方法以模板梯度稀释的倍数1、1/2、1/4、1/8和1/16的log值为横坐标，ct值为纵坐标，做图，得到的斜率是-4.16，R2是0.97，扩增效率74%，比较低，不符合要求。由于未稀释时的CT值在18左右，有人建议说模板浓度太高了，所以降低了CDNA的量，20ul体系由原来的2ul改为0.8,1.0,1.2.1.4，重新计算扩增效率仍然不理想，并没有明显的改善。又把模板浓度稀释成5倍和10倍后，再按2倍稀释，cDNA的量仍为20ul体系2ul，结果仍不理想，直线的斜率分别为-4.04、-4.54，只是相关性系数R2变为0.998和0.999。那么请问是因为引物不合适才导致的扩增效率比较低，还是扩增条件，还是其他呢。 十分困惑，请求指教，不胜感激。
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lingboxian edited on
为啥没有人回复呢。
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从你的图来看，应该是后面2个梯度影响了你的效率。是不是后面2个反应管没混好？用的是哪个公司的mix？
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用的是天根的mix。还有一个问题是2倍稀释和5倍稀释以及10倍稀释来计算扩增效率有什么区别呢
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lingboxian 用的是天根的mix。还有一个问题是2倍稀释和5倍稀释以及10倍稀释来计算扩增效率有什么区别呢没有太大的区别吧，如果混好了的话，我们一般都是用10倍来稀释的，效果更好点。
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丁香园中级站友
不知道你用的是什么机器，ABI、MJ和伯乐的机器可以直接显示标准曲线的。我感觉你每个梯度只做了一个空，应该做三个复孔。建议：1，不知道你扩增的片段有多长，如果不超过300bp，可以延伸30秒，
2，增加引物的浓度。我用的是宝生物的，终浓度0.2就可以，适当增加可以增加扩增效率，同时降低了特异性，找好平衡点。
3，稀释方法：5倍稀释。20ul体系。取4ulcDNA加16ul ddH2O，混匀后每孔加4ul，三孔共12ul，另取4ul再加16ul作为下个梯度用。做5个梯度就够了。
一般来讲稀释倍数越高，误差越小。最好能够10倍稀释，但是以cDNA做模板根本达不到。
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首先谢谢你的回复，我用的机器型号是Stratagene MX3005p. 其实是每个梯度做了3个副孔，刚没有说清楚，而且稀释方法和你讲到的是一样的。但是没有注意到稀释倍数和误差的关系，谢谢你的提醒。还有就是引物的浓度对扩增效率有影响，那您能不能系统的告诉我，如何调节一个引物的扩增效率，退火温度，引物浓度，延伸的时间，哪儿个是关键，或者还有哪些因素是可以调节的。谢谢您的回复。
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大家好，我刚开始做荧光定量，我用的是Eva Green，最近做的总是扩增 效率比较低，R2较高，或者扩增效率高，R2低，想请大家指导一下。
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【求助】荧光定量PCR，扩增效率不佳，求帮助
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这个帖子发布于3年零174天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
各位老师、师兄师姐好，
小弟最近在做外周血基因组DNA的荧光定量PCR，仪器用的是eppendorf的。目的基因CT值在22左右，内参基因在16左右。建立标准品，浓度为64、32、16、8、4、2、1ng/ul，每个梯度三个复孔，反应体系10ul（荧光MIX5，引物各0.2，ddH20 4.6ul）。第一批实验：目的基因和内参基因的标准曲线如下，
Y=-4.262logX+47.262
扩增效率71.65%
Y=-2.551logX+36.447
扩增效率146.60% 重复一次，
Y=-4.262logX+47.262
扩增效率71.65%
Y=-3.329logX+42.018R=0.996
扩增效率99.71% 更改过标准品后：
Y=-3.222logX+39.657
扩增效率=104.17%
Y=-3.329logX+42.108
扩增效率99.7% 重复一次，
Y=-3.721logX+42.863
扩增效率=85.7%
Y=-3.305logX+41.659
扩增效率=100.71%
由上述看来，标准曲线的R2可，表明拟合度好，但目的基因的扩增效率普遍不好，而内参基因扩增效率可。为什么每次试验的扩增效率不具有重复性呢（体系配备和反应条件、操作手法类似情况下）。是引物的原因吗（南京金斯瑞公司合成，我感觉这个公司合成的引物不好，之前用过）。初来乍到，啥都不会，向大家请教，下一步该怎么解决，重新合成引物或设计引物？更改反应体系？其他？
万分谢谢！~
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dooctor 各位老师、师兄师姐好，
小弟最近在做外周血基因组DNA的荧光定量PCR，仪器用的是eppendorf的。目的基因CT值在22左右，内参基因在16左右。建立标准品，浓度为64、32、16、8、4、2、1ng/ul，每个梯度三个复孔，反应体系10ul（荧光MIX5，引物各0.2，ddH20 4.6ul）。第一批实验：目的基因和内参基因的标准曲线如下，
Y=-4.262logX+47.262R=0.998R2=0.996扩增效率71.65%
Y=-2.551logX+36.447R=0.984R2=0.968扩增效率146.60%重复一次，
Y=-4.262logX+47.262R=0.998R2=0.996扩增效率71.65%
Y=-3.329logX+42.018R=0.996R2=0.991扩增效率99.71%更改过标准品后：
Y=-3.222logX+39.657R=1.000R2=0.999扩增效率=104.17%
Y=-3.329logX+42.108R=0.996R2=0.991扩增效率99.7%重复一次，
Y=-3.721logX+42.863R=0.997R2=0.993扩增效率=85.7%
Y=-3.305logX+41.659R=0.997R2=0.993扩增效率=100.71%
由上述看来，标准曲线的R2可，表明拟合度好，但目的基因的扩增效率普遍不好，而内参基因扩增效率可。为什么每次试验的扩增效率不具有重复性呢（体系配备和反应条件、操作手法类似情况下）。是引物的原因吗（南京金斯瑞公司合成，我感觉这个公司合成的引物不好，之前用过）。初来乍到，啥都不会，向大家请教，下一步该怎么解决，重新合成引物或设计引物？更改反应体系？其他？
万分谢谢！~你好，我们可以帮忙设计合成检测引物，保证成功率。。SLBioSci,
项目经理QQ:
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dooctor 各位老师、师兄师姐好，
小弟最近在做外周血基因组DNA的荧光定量PCR，仪器用的是eppendorf的。目的基因CT值在22左右，内参基因在16左右。建立标准品，浓度为64、32、16、8、4、2、1ng/ul，每个梯度三个复孔，反应体系10ul（荧光MIX5，引物各0.2，ddH20 4.6ul）。
目的基因的扩增效率普遍不好，而内参基因扩增效率可。为什么每次试验的扩增效率不具有重复性呢（体系配备和反应条件、操作手法类似情况下）。是引物的原因吗（南京金斯瑞公司合成，我感觉这个公司合成的引物不好，之前用过）。初来乍到，啥都不会，向大家请教，下一步该怎么解决，重新合成引物或设计引物？更改反应体系？其他？
万分谢谢！~扩增效率你不必过于纠结，同一个样本同一批次同一个人同一体系下操作都有可能出现较大差别，主要还是看CT值；另外你如果做的相对定量，个人觉得扩增效率可以忽略。。。
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ljroger3600 扩增效率你不必过于纠结，同一个样本同一批次同一个人同一体系下操作都有可能出现较大差别，主要还是看CT值；另外你如果做的相对定量，个人觉得扩增效率可以忽略。。。谢谢！在内参基因和目的基因扩增效率都好的情况下，算出来的拷贝数（2^目的基因CT-内参基因）明显与其他批次实验的不一样。所以我纠结的是模板浓度过高、或过低，引物的原因等。补充下，内参基因的CT值在16左右，目的基因在22左右。
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cnsder 你好，我们可以帮忙设计合成检测引物，保证成功率。。SLBioSci,
项目经理QQ:有需要的话可以的。但事实上你没有回答我的问题啊。
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dooctor 谢谢！在内参基因和目的基因扩增效率都好的情况下，算出来的拷贝数（2^目的基因CT-内参基因）明显与其他批次实验的不一样。所以我纠结的是模板浓度过高、或过低，引物的原因等。补充下，内参基因的CT值在16左右，目的基因在22左右。CT值看起来是可以的，不过看你在算拷贝数，是绝对定量？我没有做过，但绝对定量的话应该有已知拷贝数的阳性对照吧（或者类似质控的样本），看一下阳性对照（或质控）的情况是否符合本应该出现的情况，应该就可以判断数据能不能用了。。。至于每一次你都要保证近乎相同的扩增效率，这个真的很恼火，效率有差异原因太多也不好找。。。个人观点，仅供参考。。。
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dooctor 有需要的话可以的。但事实上你没有回答我的问题啊。跟引物和体系有关，需要优化
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ljroger3600 CT值看起来是可以的，不过看你在算拷贝数，是绝对定量？我没有做过，但绝对定量的话应该有已知拷贝数的阳性对照吧（或者类似质控的样本），看一下阳性对照（或质控）的情况是否符合本应该出现的情况，应该就可以判断数据能不能用了。。。至于每一次你都要保证近乎相同的扩增效率，这个真的很恼火，效率有差异原因太多也不好找。。。个人观点，仅供参考。。。感谢。我做的是线粒体拷贝数，是相对定量，即线粒体DNA相对于核DNA有多少拷贝，参考文献做的话都是需要做标准曲线的。不过没有做阳性对照啊。接下来我打算更换引物，以及将模板DNA减少到1ul，再看看，等我的好消息哈
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丁香园准中级站友
期待楼主消息。
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dooctor 感谢。我做的是线粒体拷贝数，是相对定量，即线粒体DNA相对于核DNA有多少拷贝，参考文献做的话都是需要做标准曲线的。不过没有做阳性对照啊。接下来我打算更换引物，以及将模板DNA减少到1ul，再看看，等我的好消息哈要得，持续跟进哈。。。嘿嘿。。。祝实验顺利哈。。。。
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ljroger3600 CT值看起来是可以的，不过看你在算拷贝数，是绝对定量？我没有做过，但绝对定量的话应该有已知拷贝数的阳性对照吧（或者类似质控的样本），看一下阳性对照（或质控）的情况是否符合本应该出现的情况，应该就可以判断数据能不能用了。。。至于每一次你都要保证近乎相同的扩增效率，这个真的很恼火，效率有差异原因太多也不好找。。。个人观点，仅供参考。。。新合成的引物，PCR体系中将模板量降低为1ul，以上是目的基因的标准曲线（以两倍的浓度梯度稀释）。在最后的3个标准品中出现了引物二聚体，扩增效率和R值都可以，主要考虑是梯度稀释后模板量降低了；另外，实验标本的PCR未见引物二聚体。请问这样对实验影响大不大，有没有什么解决办法没有？一个师兄说可以在PCR扩增时，每个循环在延伸后添加一步，及多设置一个温度（79℃左右），以避免采集引物二聚体的荧光，请问这样可行吗？
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dooctor 新合成的引物，PCR体系中将模板量降低为1ul，以上是目的基因的标准曲线（以两倍的浓度梯度稀释）。在最后的3个标准品中出现了引物二聚体，扩增效率和R值都可以，主要考虑是梯度稀释后模板量降低了；另外，实验标本的PCR未见引物二聚体。请问这样对实验影响大不大，有没有什么解决办法没有？一个师兄说可以在PCR扩增时，每个循环在延伸后添加一步，及多设置一个温度（79℃左右），以避免采集引物二聚体的荧光，请问这样可行吗？不好意思，这几天是比较多，论坛没上。。。。个人觉得后面三个标准品产生的引物二聚体影响不大，你的溶解曲线和标准曲线都还可以。。。至于你的师兄说的这种方法我没用过，所以不清楚。。。不好意思。。。
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dooctor 感谢。我做的是线粒体拷贝数，是相对定量，即线粒体DNA相对于核DNA有多少拷贝，参考文献做的话都是需要做标准曲线的。不过没有做阳性对照啊。接下来我打算更换引物，以及将模板DNA减少到1ul，再看看，等我的好消息哈相对定量是针对于RNA来说的，您的实验应该算绝对定量吧。另外，融解曲线貌似前两个点也有小峰吧。应该是引物特异性不好，建议重新设计引物。
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tiantian 相对定量是针对于RNA来说的，您的实验应该算绝对定量吧。另外，融解曲线貌似前两个点也有小峰吧。应该是引物特异性不好，建议重新设计引物。我做的是绝对定量的相对版本。我减少了引物，结果满意，再也没有引物二聚体了。
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你好，我想请教一下如何用荧光定量的方法检测线粒体DNA的拷贝数？能否具体指点一下，不胜感激
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【求助】急！！！实时荧光定量PCR结果的统计学分析
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请教各位，实时荧光定量PCR的结果 计算出2-△△Ct后 该如何进行统计学分析？在线等！谢谢各位的帮助！！！
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同求啊！楼主现在会不？
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qunxian04 同求啊！楼主现在会不？请教了一下别人，据说计算出的值如果大于2即认为差异有统计学意义，不知道是否权威。
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我做的是3-4个平行样本，每个样本算出2-△△Ct值之后，再求平均值和标准误。
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2-△△Ct值是不是2的负（目的基因的△Ct-内参的△Ct）次方啊？
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frank_yan2009 看看这篇文章 可能对你会有帮助！谢谢，参照执行，很实用。
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frank_yan2009 看看这篇文章 可能对你会有帮助！我想知道这篇文章下载怎么还需要丁当？在国外为什么不能下载？按提示完善简历就可以有丁当，我的简历已经完善了100%，怎么还是没有丁当，能不能在这么着急的时候别这么kengdie！！！！
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gudinglan 请教各位，实时荧光定量PCR的结果 计算出2-△△Ct后 该如何进行统计学分析？在线等！谢谢各位的帮助！！！你好，请问你后来是怎么进行统计学分析的，用什么检验方法？谢谢！
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【求助】荧光定量pcr上样量问题、扩增效率问题和相对定量实验中的双标准曲线
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请各位大侠帮忙啊，小弟不胜感激!一、请问用cdna进行荧光定量pcr时模板含量和引物（内参基因引物和目的基因引物）浓度应该分别是多少呢?
二、如果用2-△△ct法那么怎样保证内参基因和目的基因的扩增效率一样且都在80%-120%之间呢?（我们的仪器没有扩增效率的显示，而且如果用标准曲线的斜率计算扩增效率时也没有标准曲线显示图）三、如果用双标准曲线法进行相对定量实验我要每个批次的平板都要做一次标曲吗？四、请问NTC(无模板对照)和NC(阴性对照)分别是什么意义呢，是不是每个批次的平板都要做一次谢谢，请各位大侠不吝赐教！
不知道邀请谁？试试他们
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1. cdna的量50ng左右，引物10uM浓度下，25ul体系中加0.5ul（根据试剂盒的说明书，不同试剂盒可能有微弱差别）。2. 不知道3. 每个平板都要做标准曲线。4. NTC是指没有加入任何模板，也就是反应体系中的所谓模板就是水或buffer；NC是指没有目的基因的模板，比如你想检测感染的细胞中某个病毒基因表达量，此时你要设一个未被感染的细胞的cdna做阴性对照。
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谢谢这位高手的热情解答，我明白了。我的cdna量大概900ng左右（可能比这小一点，毕竟测量RNA浓度时有误差），引物浓度10uM，20ul体系加入模板cdna 2ul行不行。还是将他们稀释10倍再加入?
请这位高手不吝回答
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