数据来源：国家企业信用信息公示系统、全国建筑市场监管公共服务平台等。

注意：本教程假定您已经完成，成功安装QIIME 2。

本教程计划在完成《》之后练习。它旨在介绍一些新思想，并且是应用该文档中探索工具的一个练习。

本教程中使用的数据来自，详见《》。其中18岁以下患有自闭症和胃肠道疾病的儿童，分别通过自闭症诊断访谈修订版(ADI-R)和胃肠道症状评定量表(GSRS)测量，用粪便微生物移植治疗，试图减少他们的行为异常和胃肠道症状的严重程度。我们通过18周内他们的GSRS评分追踪了他们的微生物变化，包括父母的整体状况III（Parent Global Impressions，PGI-III）和儿童孤独症评定量表（CARS），以及他们胃肠道症状的严重程度。通过每周收集粪便拭子样本（用擦拭用过的卫生纸收集）和不太频繁的大便样本（收集全大便）来跟踪微生物群。在全部研究中，这是第一阶段的临床试验，旨在测试治疗的安全性，18个人接受了治疗，20个人作为对照。对照组未接受治疗，但监测肠道微生物群的正常时间变化。本研究还对治疗期间移植的粪便材料进行了测序。

本教程数据集是为本研究数据的一个子集。它包括五个接受治疗的个体和五个对照的数据。每个个体包括6至16个样本，包括每个个体的大便和粪便拭子样本，以及FMT治疗前后样本。移植的粪便材料也包括五个样本。

MiSeq测序批次（Run）中测序。如《人体各部位微生物组教程》所示，我们将使用执行初始质量控制并生成FeatureTable[Frequency]和FeatureData[Sequence]对象。然而，DADA2去噪过程只适用于一次单个测序批次，因此我们需要在每个测序批次的基础上运行该过程，然后合并结果。我们将完成这个初始步骤，然后提出一些可以作为练习来回答的问题。

详者注：此实例需要一些基础知识，要求完成学习本系列文章前两篇内容：和。

视频有广告，清晰度不够高吗？在微信订阅号“meta-genome”后台回复“qiime2”获得1080p视频和测试数据下载链接。

本实验研究自闭症且胃肠道功能紊乱患者，采用粪便菌群移植方法，来降低患者的行为异常和肠道紊乱。监测移植后18个月范围内肠道菌群的变化，上图为。

对于上文提到了conda/docker两种常用安装方法，我们每次在分析数据前，需要打开工作环境，根据情况选择对应的打开方式。

# 定义工作目录变量，方便以后多次使用
# 进入工作目录，是不是很简介，这样无论你在什么位置就可以快速回到项目文件夹
# 这时我们的命令行前面出现 (qiime2-2020.11) 表示成功进入工作环境
# 方法3. 如果是docker安装的请运行如下命令，默认加载当前目录至/data目录
 

 

 
 

 注意：QIIME 2 官方测试数据均保存在Google服务器上，国内下载比较困难。，以下Google链接全部替换为国内备份链接*。
 
 

 下载元数据，即描述样本的数据，也称实验设计。通过上述方法下载请跳过。
 
 

 接下来，下载我们将在本分析中使用的拆分好的混合样本序列。要了解如何从fastq格式的序列数据中开始QIIME 2分析，请参阅。我们需要下载两组样本拆分好的序列，每个序列文件对应一个序列测序批次。
 
 

 在本教程中，我们将使用完整序列数据的一个小子集，以便命令能够快速运行。您可以选择1%的序列子集或10%的序列子集。如果您只是试图获得准备和组合多个数据序列运行的经验，那么您可以使用1%的子集数据，以便命令可以非常快速地运行。如果您使用本教程来获得在生成和解释QIIME
 2分析结果方面的额外经验，那么您应该使用10%的子采样数据，以便结果将由更多的序列数据支持（1%的序列可能不足以支持原始研究的一些发现）。
 
 

 这里我们选择10%的子集序列用于后序列分析。
 
 

 因为10%的子集序列也非常少，才几十M，注意文件名要手动删除-10p部分。
 
 

 

 
 

 上节我们使用对样本拆分后的序列执行质量控制，但是这次我们将对每组样本拆分后序列分别运行denoise-single(单端去噪)命令。同样，我们希望可视化每批次中样本的序列质量。当我们运行denoise-single命令时，我们需要为两次分析--p-trunc-len和--p-trim-left使用相同的参数值。当查看这两个命令产生的可视化时，只有两个命令基于相同的参数分析结果进行比较才有意义，否则多变量因素导致混淆。
 
 

 
 

 
 

 

 查看可视化评估结果，也可下载qzv文件，使用 view.qiime2.org 打开查看，也可解压查看。
 
 

 
图1. 第一批数据量汇总图表
 
 

 
图2. 第一批数据质量评估图
 
 

问题：我们在两批结果中的交互质量图中观察，综合选择质控参数--p-trunc-len 和--p-trim-left的值是多少比较合理？

详者注：序列上游13 bp的序列质量偏低，设置trim-left 13截掉前13bp序列；整体到150bp的质量都不错，则trunc-len保留150 bp的序列长度。

生成特征表和代表性序列

 

 前几个碱基的质量似乎相对较低，然后似乎保持相对较高，直到序列测序结束。因此，我们将从每个序列中修剪前13个碱基，并在150个碱基处截断这些碱基。由于读数是151个碱基，这导致序列的截断非常少。
 
 

 dada2质控和去冗余，本实验有两批独立的数据，需要处理两次，生成代表序列和特征表
 
 

# 去噪生成特征表，笔记本：1m28s，服务器：2m44s
# 去噪生成特征表，笔记本：48s，服务器：1m27s
 

 


 

 

 
 

 denoise-single命令返回去噪过程的基本统计，可以使用如下命令可视化。
 
 

 
 

 

 
 
 

 图3. 第一批数据质量去噪过程统计。有非常多列，可托动下方滚动条查看；样本多，可以在右上角Search中查找。
 
 

合并不同批的代表序列和特征表

 

 
 

 在这个分析中，denoise-single命令是最后一步，它需要对每批数据独立处理。因此，我们必须合并由这两个命令生成的对象，才能继续下游分析。首先我们将合并两个FeatureTable[Frequency]对象，然后合并两个FeatureData[Sequence]对象。这种操作是可行的，因为在每次去噪denoise-single单次运行中生成的特征id是可以直接比较的（在这种情况下，特征id是定义特征序列的md5值(散列/哈希))。
 
 

 
 

 当然也可以继续增加更多的批次数据，只要使用更多次的--i-tables参数即可
 
 

 合并两组数据的代表序列
 
 

 
 

 

 特征表数据需要进行特征表统计，查看基本情况。
 
 

 
 

 

 
 
 

 图4. 特征表汇总。下面还包括样本信息的汇总图表、特征的汇总图表。此页面中还可以交互查看样本、特征的详细信息，自己在网页或本地中查看和探索结果吧！
 
 

 图片看不清，可查看下方纯文本表格
 
 

表2. 样品数据量分布

表3. 特征表频率统计

详者注：通过上表，我们可以确定特征表标准化时数据重抽样的参数，由于本测试，只用了文章原始数据的10%的数据，数据量很小，最小值为84，第一分位数为276，我们可选择276保留75%以上的样品。一般最小值1000，推荐5000以上，如果数据量都很大3-5万更好。

问题2. 生成qiime dada2 denoise-single单批次数据结果汇总表中，查看第一批数据中定义了多少特性？在第二批数据中定义了多少特性？这些数字与合并后的特性总数相比如何？

我们还将生成合并后的FeatureData[Sequence]对象的摘要。在进行分析时，可以使用此摘要获得感兴趣特性的额外信息。

图5. 特征序列长度统计。
基本统计、分位数和序列详细。可点击序列进行NCBI blast查看详细注释。

Sequences)FeatureData[Sequence]对象，你可以基于样本元数据来探索其微生物组成。自己尝试用上篇文章《》（2020.11版）分析方法。几个问题与个体的微生物组的纵向变化有关；可以参考，后面的教程中会详细讲解，到时可以学习此类分析方法。试着回答以下问题？

1. 按个体(subject-id)分类是否存在组成差异？
2. 按个体分类存在丰富度差异吗？
3. 按个体分类存在均匀度差异吗？
4. 在起始和研究终点间，个体的丰富度、均匀度、组成和UniFrac距离发生改变了吗？(尝试中的成对差异/距离方法)
5. 丰富度、均匀度、物种组成、UniFrac距离与是否粪菌移植FMT或其它个体元数据有什么关系？处理组和对照组随时间变化大吗？（提示：有关时间序列分析，即使现在不懂也没关系，后面的章节会详细介绍，学完后再回来回答这些问题）
1. 移植几周后，患者的菌群在Bray-Curtis距离下最像供体；
2. 比较两种距离结果那种更好解释；
1. 实验设计：比较粪便和试子样品采集方法；
   1. 比较不同取样方法结果中最大差别的特征？差异特征用blast，或机器学习classifier注释有什么不同？
2. 供体粪便与那种取样的结果更像？
3. 两类取样方法的Alpha多样性存在差别吗？

• 每个测序批次中有多少样品？在不同测序批次中是否存在系统性差异？

你已经获得了特征表、代表序列，还有你的实验设计。只需要《》（2020.11版）中构建进化树用于多样性分析开始往后的代码运行一遍，再交互式探索结果，上面的问题的答案不言自明。

我们要考虑个体间是否存在差异，一般从整体描述角度，多查看Beta多样性分析结果，当然也可以查看Alpha或Taxonomy的差异。这里以最常用的Bray-Curtis距离下的Beta多样性为例来回答此问题。

# 构建进化树用于多样性分析
# Alpha和beta多样性分析，选择合适的抽样数量，观察table.qzv，仅有一个样小于1150
 

 


 

1.2/3 按个体分类存在丰富/均匀度差异吗？

 
 

 
 

 Alpha多样性subject组间显著性分析和可视化
 
 

 
 

 
 

 此外，此图还可以查看更多分类型分组间是否存在多样性的差别。均匀度查看evenness-group-significance.qzv文件即可，同理，我们发现按subject-id分组没有q-value < 0.05的组，但有两组存在 q-value = 0.06，在没有更好的实验候选下也值得关注。
 
 

1.4/5 时间序列上的统计

 

 我们在学完后面的教程再补充答案，有基础的同行，可根据后面的章节参考代码自行尝试。
 
 

2. 菌群移植在时间上的Beta多样性

1. 移植几周后，患者的菌群在Bray-Curtis距离下最像供体；
2. 比较两种距离结果那种更好解释；

 

 
 

 我们以unweighted_unifrac距离为例，查看core-metrics-results/unweighted-unifrac-emperor-week.qzv结果，把Color分组着色选为week，看到样本在week轴上展开非常好。再切换Sahpe面板，修改treatment-group的形状为diamond，这样可以按不同形状分清供体和受试者。看到蓝色0周时与供体更像吗？同理，可查看bray_curtis距离的结果，规律如何呢？一般个人觉得Bray-Curtis距离有更好的解释，而且有权重比无权重更可信，更有意义。在不同场景下可能有不同的解读。
 
 

 还可以进一步评估样本的测序量是否饱和，或从稀疏曲线中观察各组、时间点间的变化规律
 
 

3. 实验设计：比较粪便和试子样品采集方法；

1. 实验设计：比较粪便和试子样品采集方法；
   1. 比较不同取样方法结果中最大差别的特征？差异特征用blast，或机器学习classifier注释有什么不同？（按采集方法分组计算差异ASV）
2. 供体粪便与那种取样的结果更像？
3. 两类取样方法的Alpha多样性存在差别吗？

4. 每个测序批次对多少样品进行了测序？

 

 在各种测序批次间，您是否观察到样品间的系统差异？
 
 

 

 刘永鑫，博士，中科院青促会会员，QIIME 2项目参与人。2008年毕业于东北农业大学微生物学专业，2014年于中国科学院大学获生物信息学博士，2016年遗传学博士后出站留所工作，任工程师。目前主要研究方向为宏基因组数据分析。目前在Science、Nature Biotechnology、Protein &
 Cell、Current Opinion in Microbiology等杂志发表论文30余篇，被引2千余次。2017年7月创办“宏基因组”公众号，目前分享宏基因组、扩增子原创文章2400余篇，代表作有、 、等，关注人数11万+，累计阅读1800万+。
 
 

 

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东北农业大学院校代码：10224。东北农业大学简称为“东北农大”，位于黑龙江省哈尔滨市，是世界一流学科建设高校，国家首批“211工程”重点建设高校。

东北农业大学简称为“东北农大”，位于黑龙江省哈尔滨市，是世界一流学科建设高校，国家首批“211工程”重点建设高校，黑龙江省人民政府与中华人民共和国农业部共建高校，入选国家中西部高校基础能力建设工程、卓越农林人才教育培养计划项目试点、高等学校创新能力提升计划，是全国首批博士、硕士学位授予单位，黑龙江省重点建设的省属特色高水平大学，“援疆学科建设计划”，首批高等学校科技成果转化和技术转移基地。